烏梅丸對T2DM模型大鼠GLP-1及NF-κB p65的影響*

朱亮

華北理工大學中醫學院，河北 唐山 063210

從歷年統計數據來看，我國2型糖尿病(diabetes mellitus type 2，T2DM)發病數量呈上升趨勢，已經成為危害人類健康的三大慢性非傳染性疾病之一。目前，本病的發生發展機制尚未完全闡明，但有研究表示，其發生與胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)和核轉錄因子-κB p65(nuclear factor p65，NF-κB p65)表達有一定關系[1-2]。GLP-1可抑制葡萄糖的產生，并通過改善胰島β細胞功能來控制血糖。NF-κB p65與炎癥因子釋放有密切關聯，可通過釋放促炎癥因子，加強胰島素抵抗，導致機體血糖水平升高。關于T2DM的治療，現階段還未有根治方案，臨床主要以控制血糖為主，現用降血糖藥物雖療效顯著，但亦存在諸多不良反應[3-4]。早在幾千年前，中醫就對T2DM有了深刻的認識，并對其病因、體征等做了一定說明，與現代醫學中的T2DM認知保持高度的一致性，同時也為T2DM的防治提供了較為詳盡的指導。烏梅丸出自《傷寒論》，是目前治療T2DM的常用方，但關于其對GLP-1及NF-κB p65表達的影響研究卻較少，因此，本研究以T2DM模型大鼠為研究對象展開討論，希望為臨床治療提供實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物健康雄性SPF級Wistar大鼠70只，鼠齡30 d，體質量180～210 g，來源和飼養單位均為華北理工大學動物實驗中心。飼養環境：溫度23～28℃，濕度(60.00±10.00)%，光暗周期12 h，光照時間0600-1800，自由取食和飲水。本研究已獲得華北理工大學實驗動物倫理委員會批準。研究開始前，所有大鼠適應性喂養1周。大鼠處死方法：斷頭式。整個研究將嚴格遵守《實驗動物管理條例》。

1.2 藥物與試劑烏梅、細辛、干姜、黃連、當歸、附子、蜀椒、桂枝、人參、黃柏、石膏、澤瀉(華北理工大學附屬醫院)；羅格列酮(上海源葉生物科技有限公司，貨號：S70212)。無菌生理鹽水(青島高科技工業園海博生物技術有限公司，貨號：HBPT033)；總膽固醇(total cholesterol，TC)試劑盒、GLP-1抗體(上海鈺搏生物科技有限公司，貨號：yb-E11927、yb00696)；三酰甘油(triglyceride，TG)試劑盒(上海優科唯生物科技有限公司，貨號：YKW-20504)；高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)試劑盒(上海初態生物科技有限公司，貨號：CT68485)；低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)試劑盒(合肥萊爾生物科技有限公司，貨號：LE-B1211)；檸檬酸(上海甄準生物科技有限公司，貨號：ZCA-INP107)；檸檬酸三鈉、鏈脲佐菌素(上海源葉生物科技有限公司，貨號：S67462、S17049)；NF-κB p65抗體(上海戶實醫藥科技有限公司，貨號：HK6160)。

1.3 儀器精密電子天平(聚儀惠發展有限公司，型號：JA1003N-5003N)；冷凍高速離心機(德國Handelsen公司，型號：Sigma2-16P，離心半徑：10 cm)；可見分光光度計(上海尤尼克儀器有限公司，型號：UNIC 7200)；多功能酶標儀(賽默飛世爾科技，型號：Varioskan LUX)；雙板垂直電泳儀(北京六一生物科技有限公司，型號：DYCZ-24DH)；全自動輪轉式切片機(上海興曼生物科技有限公司，型號：RM2255)；凝膠成像系統(廣州光儀生物科技有限公司，型號：OI 1000)。

2 方法

2.1 藥物制備烏梅丸溶液的制備：稱取烏梅丸組方藥材烏梅30 g，細辛3 g，干姜9 g，黃連9 g，當歸 6 g，附子9 g，蜀椒5 g，桂枝6 g，人參6 g，黃柏6 g，石膏6 g，澤瀉6 g。諸藥粉碎，過20目篩，混合，加藥材8倍量水，浸泡 0.5 h，大火煮開文火慢煎2 h，紗布過濾。濾渣中加藥材6倍量水，大火煮開小火慢煎2 h，再次過濾，合并2次水煎液，水浴恒溫器上濃縮至濃度為5 kg·L-1(含生藥)的藥液，滅菌后冰箱冷藏備用。

檸檬酸緩沖溶液制備：取2.1 g檸檬酸與 2.94 g 檸檬酸三鈉，分別溶解于100 mL蒸餾水中，充分混勻后，取檸檬酸溶液28 mL及檸檬酸三鈉溶液 22 mL 進行充分混合，蒸餾水定容至100 mL，調節pH為4.4，滅菌處理，所得溶液即為檸檬酸緩沖溶液。

鏈脲佐菌素溶液配置：取20 mg鏈脲佐菌素充分溶解于1 mL檸檬酸緩沖溶液中，得到的鏈脲佐菌素溶液過濾滅菌，冰浴避光待用。

2.2 大鼠分組、T2DM模型建立及給藥從70只健康雄性SPF級Wistar大鼠中隨機選取10只作為空白對照組，其余60只大鼠建立T2DM模型。模型建立如下：建模大鼠采用高脂飼料(飼料配方：10%熟豬油、20%蔗糖、2.5%膽固醇和1%膽酸鹽)喂養，連續喂養5周后，禁食不禁水12 h，給予大鼠尾靜脈注射鏈脲佐菌素溶液，劑量35 mg·kg-1。1周后測量空腹血糖，若空腹血糖<7.8 mmol·L-1，再次尾靜脈注射35 mg·kg-1鏈脲佐菌素溶液。空白對照組注射等體積的檸檬酸緩沖溶液。2周后(期間繼續給予高脂飼料喂養)，大鼠禁食12 h，空腹血糖>11.1 mmol·L-1，即建模成功。將上述血糖水平維持14 d的大鼠納入研究。在此期間空白對照組采用基礎飼料喂養，所有大鼠自由飲水。從建模成功的大鼠中選取30只，隨機分為模型對照組、烏梅丸組、羅格列酮組，烏梅丸組以3 mL·kg-1的體積灌胃給予20 g·kg-1(生藥量)的烏梅丸溶液，羅格列酮組灌胃給予等體積1.42 mg·kg-1的羅格列酮溶液，空白對照組與模型對照組灌胃給予等體積生理鹽水，每天1次，持續干預6周。

2.3 觀察指標

2.3.1 一般情況3人同時觀察用藥6周后大鼠的一般情況，如皮毛、精神狀態、大便、小便、飲水、飲食等。若有分歧，采用少數服從多數原則。體質量由專人每日測量，并統計用藥前(0周)、用藥后(2周、4周、6周)各組大鼠體質量變化。

2.3.2 空腹血糖用藥前后血糖儀測量空腹血糖。大鼠禁食不禁水12 h后，7.5%水合氯醛麻醉其眼眶后取血1.5 mL，離心后取上層清液于離心管內，按照葡萄糖試劑盒說明書進行血糖測量，使用可見分光光度計讀取吸光度，得到血糖值。

2.3.3 結腸組織GLP-1及NF-κB p65蛋白表達水平6周后處死大鼠，取其結腸組織，制成組織蛋白。將組織蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，恒溫環境下5%脫脂牛奶封閉液中封閉，1×TBST洗膜，分別加入NF-κBp65一抗(11 000)、GLP-1一抗(1500)、內參GAPDH(11 000)，搖床過夜，洗膜后以辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗(110 000)孵育，顯影液覆蓋PVDF膜，凝膠成像儀曝光后凝膠圖像分析軟件分析。目的蛋白灰度值/內參灰度值來反映目的蛋白的半定量表達。

2.3.4 血脂相關指標將制好的大鼠血清標本解凍離心后，按照試劑盒說明書操作測量TC、TG、HDL-C 和LDL-C的含量。

3 結果

3.1 各組大鼠一般情況比較空白對照組大鼠皮毛光亮、活潑喜動、精神良好、飲水飲食正常、二便正常；造模大鼠皮毛黯淡泛黃、嗜睡懶動、精神萎靡、飲水飲食和小便均明顯增多，體形偏瘦；給予藥物干預后，大鼠多飲、多食、多尿現象均有所改善。與空白對照組比較，模型對照組大鼠體質量降低；與模型對照組比較，給藥2周、4周、6周后烏梅丸組和羅格列酮組大鼠體質量增加，差異均具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

3.2 各組大鼠空腹血糖比較與空白對照組比較，模型對照組大鼠的空腹血糖水平升高；與模型對照組比較，給藥2周、4周、6周后烏梅丸組、羅格列酮組大鼠的空腹血糖水平降低，差異均具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠不同時間空腹血糖比較

3.3 各組大鼠結腸組織GLP-1及NF-κB p65蛋白表達水平比較與空白對照組比較，模型對照組大鼠結腸組織GLP-1蛋白表達水平降低，NF-κB p65蛋白表達水平升高；與模型對照組比較，烏梅丸組、羅格列酮組大鼠結腸組織GLP-1蛋白表達水平升高，NF-κB p65蛋白表達水平降低，差異均具有統計學意義(P<0.05)。見表3、圖1。

表3 各組大鼠結腸組織GLP-1及NF-κB p65蛋白表達水平比較

注：A：空白對照組，B：模型對照組，C：羅格列酮組，D：烏梅丸組圖1 大鼠結腸組織GLP-1及NF-κB p65蛋白表達電泳圖

3.4 各組大鼠血脂水平比較與空白對照組比較，模型對照組大鼠TG、TC及LDL-C水平升高，HDL-C 水平降低；與模型對照組比較，烏梅丸組、羅格列酮組大鼠結腸組織HDL-C水平升高，TG、TC及 LDL-C水平降低，差異均具有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠血脂水平比較

4 討論

T2DM是一種慢性代謝性疾病，主要由胰島素抵抗引起，從而使機體處于高血糖狀態。長期高血糖將引起糖尿病視網膜病變、糖尿病腎病等一系列綜合征，對患者生命健康造成威脅[5-6]。現階段，臨床主要采用的控糖藥物有噻唑烷二酮類、α-糖苷酶抑制劑、雙胍類等，但該類藥物作用途徑相對單一，且長期服用可能會導致一些副作用，如雙胍類可能會引起腎損傷，噻唑烷二酮類則可引起肝毒性等[7-8]。因此，尋找更安全有效的藥物治療T2DM一直都是臨床關注的熱點。

T2DM屬中醫學“消渴癥”范疇，最早出自于《黃帝內經》，《素問·奇病論》云：“此人必數食甘美而多肥也……轉為消渴。”除“消渴”外，歷代醫家根據T2DM病理和癥狀差異，又將其歸屬于“消中”“膈消”“肺消”等范疇。從病因上看，消渴的發生與厥陰肝經有密切關聯，屬于厥陰病，《醫理真傳》記載消渴癥生于厥陰，風木主氣，蓋以厥陰下水而上火，風火相煽而致[9-10]。從五行角度來看，肝屬木，專欲疏泄，若疏泄不遂，則氣機升降失調，水谷精微無法正常運化。血糖屬于“水谷精微 ”范圍，肝失疏泄致糖無法化精而停聚于脈，故血糖升高[11]。情志不暢，則可郁而化火，灼傷津液，致脈中糖分聚集，故治療T2DM宜從疏肝瀉火入手[12-13]。

烏梅丸方中君藥烏梅味酸，具有斂肝疏肝之效，可使厥陰風木降而消火灼；臣藥人參味甘可補元氣，并止渴生津；再佐以細辛、干姜、附子、桂枝、蜀椒等皆屬木的辛溫之物，可溫陽守中、升補肝氣。方中黃連、黃柏一主清上，一主清下，可泄心包相火，使郁火得清而厥陰之氣留存[14-15]。當歸補肝養血、石膏清熱解煩渴、澤瀉泄火除熱。全方寒熱并行，補瀉兼備，集疏肝調氣，泄郁除火為大成，符合《黃帝內經》所載“治厥陰之客，以辛補之，以酸寫之，以甘緩之”的理念[16-17]。故用藥后，烏梅丸組T2DM模型大鼠表征和空腹血糖較模型對照組均有所改善。現代醫學中T2DM又被稱為“糖脂病”，而控制血脂有利于減輕胰島素抵抗，從而達到預防和治療本病的目的[18-19]。研究表示，烏梅丸可控制血脂水平，通過降低脂聯素水平增強胰島β細胞功能，增強外周組織對葡糖糖的利用率[20-21]。本研究發現，烏梅丸組血脂水平優于模型對照組。GLP-1是一種肽類激素，具有增強胰島素活性，抑制葡萄糖產生的作用[22-23]。大量實驗證明，GLP-1類似物對緩解糖尿病癥狀有良好的效果[24-25]。NF-κB p65主要掌控炎癥因子釋放，T2DM大鼠NF-κB通路被激活，導致炎癥因子增多，直接損傷胰島細胞，從而使機體糖代謝紊亂[26-27]。故而，模型對照組NF-κB p65水平高于空白對照組，烏梅丸可通過降低NF-κB p65水平，并上調GLP-1，從而對T2DM大鼠起到良好的防治效果，吳帆等[28]的研究亦證明了該點。

綜上所述，烏梅丸可明顯改善T2DM大鼠表征，調節其糖脂代謝水平，其作用機理可能與抑制 NF-κB p65表達，上調GLP-1水平有一定關聯。