大孔樹脂純化藍刺頭中總黃酮生產(chǎn)工藝探討

羅愛勤， 曹穎男， 鐘春燕

（廣州新華學院，廣東廣州 510520）

藍刺頭是菊科植物藍刺頭 （Echinops Latifolius Tausch.）的干燥頭狀花序，被列入衛(wèi)生部蒙藥分冊中，有苦、稀、輕、軟、鈍、涼等藥性（國家藥典委員會，1998）。張勇等（2018）和巴音額古樂等（2015）研究證實，藍刺頭可以穩(wěn)固骨骼、接骨愈傷、退熱止痛，用于治療骨折、骨熱、刺痛、瘡瘍等癥。劉巖等（2017）研究表明，藍刺頭可以降低血清骨鈣素（BGP）水平，因其具有類雌激素樣活性作用，能上調(diào)去卵巢大鼠ERα和ERβ的表達，從而促進骨骼形成，調(diào)節(jié)骨骼吸收與骨形成的偶聯(lián)，降低骨轉化速率，減小骨缺失，可有效防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。王佳琪等（2018）研究藍刺頭等化學成分，并從中分離得黃酮類化合物，謝友良等（2019）對藍刺頭化學成分的相關研究進行了綜述，表明其主要黃酮類化合物為芹菜素及其苷。芹菜素具有明顯的雌激素樣活性作用，巴音額古樂等（2015）、寇詠梅（2013）和朱瑞清（2012）研究表明，芹菜素發(fā)揮雌激素樣活性作用的信號通路與雌激素活性信號通路不完全一樣，B環(huán)位置是雌激素樣活性作用的一個重要位點。因此，總黃酮、芹菜素及其苷是藍刺頭中重要的藥理活性成分，本文研究了藍刺頭中總黃酮的富集工藝過程，旨在為藥用植物藍刺頭的開發(fā)應用和產(chǎn)業(yè)化奠定試驗基礎。此外，藍刺頭在內(nèi)蒙也作為畜牧料草使用，對藍刺頭的深入研究也能促進當?shù)氐霓r(nóng)牧業(yè)發(fā)展。

1 儀器和材料

1.1 儀器BS210S電子天平 （德國Sartorius）、UV-2550紫外分光光度計（島津）、KQ-400GKDV超聲波清洗機（昆山市超聲波設備有限公司）

1.2 材料 芹菜苷標準品 （≥98.0%，批號C12209806，質(zhì)量分數(shù)98%，上海銘博生物科技有限公司），藍刺頭藥材（保定仙德中藥銷售公司，批號100210301，經(jīng)廣州新華學院藥學院鑒定系菊科植物藍刺頭的干燥頭狀花序），大孔樹脂D101、AB-8、X-5、HPD-400、NKA-9（天津南大樹脂科技有限公司），其他試劑（分析純），純化水。

2 方法和結果

2.1 紫外-可見分光光度法測定總黃酮

2.1.1 標準溶液的制備 取適量芹菜苷標準品，精密稱定，裝入10 mL量瓶中，加入60%乙醇，制成每毫升含有芹菜苷0.328 mg的溶液，即得。

2.1.2 標準曲線的制備 精密吸取芹菜苷標準溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL， 分 別 裝 入10 mL量瓶中，加入5%三氯化鋁溶液3 mL，然后加入60%乙醇至刻度，充分搖動后靜置30 min。采用紫外-可見分光光度法測定（中國藥典2020年版四部通則0401），在波長275 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標、濃度為橫坐標繪制標準曲線（國家藥典委員會，2020）。所得回歸方程為Y＝0.0357X-0.0065，r＝0.99994。 結果顯示，芹菜苷標準品在3.28～32.8 μg/mL與吸光度值呈良好的線性關系。

2.1.3 測定法 精密吸取樣品溶液1.0 mL，裝入10 mL測量瓶中，加入5%三氯化鋁溶液3 mL，再加入60%乙醇至刻度，充分振蕩后放置30 min。按照標準曲線的制備方法，依法測量吸光度，從標準曲線中讀出樣品溶液中所包含的芹菜苷量（μg），計算，即得。

2.2 上樣液的制備 取適量藍刺頭（粉碎），用10倍55%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并55%乙醇提取液，回收乙醇并濃縮至適量，加水使稀釋至藥材量的10倍，于4000 r/min離心分離10 min，取出上清液，即得。

2.3 大孔樹脂的預處理 按照蘭海等 （2020）的試驗方法，將大孔吸附樹脂用水浸泡3次，20 min/次，過濾，用乙醇煮沸30 min，過濾，再用乙醇浸泡24 h，備用。

2.4 樹脂型號篩選 利用靜態(tài)吸附試驗，確定大孔樹脂的比吸附量和解吸量，篩選出最佳樹脂類型。 取D101、AB-8、X-5、HPD-400和NKA-9大孔樹脂進行預處理，稱取2 g處理后的樹脂分別裝入不同錐形瓶中，加入50 mL樣品溶液（含總黃酮5 mg/mL），靜態(tài)吸附24 h，吸附平衡后，過濾，向吸附溶液中加水至50 mL，測定溶液中總黃酮量，計算吸附量（吸附量＝樣品溶液總黃酮量-吸附后溶液中總黃酮量）和比吸附量（比吸附量＝吸附量/樹脂量），結果如表1所示。

表1 大孔樹脂對藍刺頭溶液中總黃酮的靜態(tài)吸附

取吸附后的樹脂，用純化水浸泡2次（100 mL、30 min/次），濾干，向樹脂中加入100 mL 80%乙醇，靜態(tài)吸附24 h，過濾，取濾液，加入80%乙醇，定容為100 mL，測定80%乙醇溶液中總黃酮量（即解吸量），計算比解吸量（比解吸量＝解吸量/樹脂量）和解吸率（解吸率＝解吸量/吸附量），結果見表2。

新生兒氣胸常并發(fā)新生兒濕肺、新生兒肺炎、新生兒吸入綜合征，嚴重影響新生兒生活質(zhì)量。因此，及時診斷并治療新生兒氣胸對改善其預后有著較為重要的作用[3-4]。

表2 吸附后大孔樹脂對藍刺頭總黃酮的靜態(tài)解吸

從表1和表2結果中可以清楚地看出，不同極性的大孔樹脂對藍刺頭總黃酮具有一定的吸附作用，其中，D101、AB-8和X-5大孔樹脂對藍刺頭總黃酮的吸附作用明顯強于HPD-400和NKA-9大孔樹脂，AB-8大孔樹脂的吸附性能最佳。D101大孔樹脂的解吸能力較其他類型的樹脂要弱，其他大孔樹脂可以完全解吸藍刺頭總黃酮。因此，綜合考慮吸附和解吸，選擇AB-8大孔樹脂進行下一步研究。

2.5 動態(tài)吸附試驗研究

2.5.1 藍刺頭上樣液濃度對大孔樹脂比吸附量的影響 按2.2.1項下方法，制備總黃酮含量為3.01、4.23、5.17、6.04、7.18 mg/mL的藍刺頭上樣液各300 mL，取AB-8大孔樹脂進行預處理后分成5份，每份15.50 g，分別加入上述上樣液中，然后進行靜態(tài)吸附，分別于靜態(tài)吸附1、2、3、4、5、6、7、8、10 h后取樣，測定取樣液中總黃酮量，結果見表3。

表3 藍刺頭上樣液濃度對AB-8大孔樹脂比吸附量的影響

從表3中可以看出，隨著吸附時間的延長，AB-8大孔樹脂對不同濃度藍刺頭上樣液的比吸附量逐漸增加；大孔樹脂吸附1 h后對初始含量為6.04 mg/mL的藍刺頭上樣液的比吸附量要比其他濃度上樣液的高，但吸附時間大于1 h后，樹脂對該濃度上樣液的比吸附量的增加幅度小于其他濃度上樣液，表明AB-8大孔樹脂可以在短時間內(nèi)從初始含量為6.04 mg/mL的藍刺頭上樣液中吸附總黃酮，達到基本飽和。

2.5.2 最大上樣體積的考察 將AB-8大孔樹脂進行預處理，稱取12.5 g濕法裝柱（φ=1cm徑高比1：8），取總黃酮量6.04 mg/mL的藍刺頭上樣液200 mL加入樹脂柱中，收集流出液（10 mL/管），分別檢測累積流出液中總黃酮量，結果見表4。

表4 累積流出液中總黃酮含量測定結果

由表4可知，累積流出液達到150 mL以上時，從流出液中檢測出總黃酮，表明有總黃酮泄露，累積體積157 mL為總黃酮含量的拐點，因此對總黃酮含量為6.04 mg/mL的藍刺頭上樣液，其上樣體積不宜超過150 mL。

2.5.3 上樣液吸附速度對樹脂比吸附量的影響取AB-8大孔樹脂進行預處理，稱量9.65 g濕法裝柱，再取總黃酮含量6.04 mg/mL的藍刺頭上樣液300 mL， 分別以每小時0.5、1、1.5、2、2.5倍樹脂柱體積的速度進行動態(tài)吸附，然后用純化水以2 BV/h的速度進行清洗除雜，收集流出液，測定流出液中總黃酮量，計算樹脂比吸附量，結果見表5。

表5 上樣速度對比吸附量的影響

由表5結果可看出，在0.5 BV/h和1.0 BV/h上樣吸附速度下，AB-8大孔樹脂對上樣液的比吸附量高于其他速度，而0.5 BV/h和1.0 BV/h的上樣速度下，樹脂的比吸附量沒有明顯差異，但是上樣速度慢，吸附時間長。

圖1 不同徑高比AB-8大孔吸附樹脂對藍刺頭總黃酮的動態(tài)吸附和解吸效果比較

2.6 響應面優(yōu)化試驗設計

2.6.1 試驗結果 根據(jù)動態(tài)吸附試驗研究結果，設計3因素3水平（表6），運用Box-Behnken中心組合設計的基本原理，按照張沛等（2021）和牛鶴麗（2021）的試驗方法，進行了RSM分析試驗，按表8分別使用AB-8大孔樹脂動態(tài)吸附藍刺頭上樣液后，以純化水4 BV進行除雜（2 BV/h），然后用80%乙醇4 BV進行洗脫 （1 BV/h），接收80%乙醇洗脫液，回收溶劑并干燥得干膏，測定干膏中總黃酮的含量，以考察上樣液濃度（A）、上樣速度（B）和樹脂徑高比（C）對純化后所得干膏中總黃酮含量（Y）的影響，結果見表7。

表6 Box-behnken試驗設計因素水平

表7 響應面試驗結果

2.6.2 響應曲面方差分析 通過多元回歸對上述試驗結果的參數(shù)進行了模擬，以總黃酮含量為目標函數(shù)，得出了各參數(shù)水平的多元二次方程：Y＝65.90+0.0875A+0.3375B-0.275C-0.6AB-0.325AC-0.075BC-4.23A2-2.38B2-2.40C2，對此進行顯著性檢驗和方差分析，結果如表8所示。

表8 響應面方差分析

從表8中可以看出，該回歸模型P＜0.01表示二次回歸方程的模型顯著，失擬項P＝0.0716＞0.05表示該回歸方程的擬合度高，誤差對試驗結果影響較小，模型可靠，R2＝0.9745表明模型可充分擬合試驗數(shù)據(jù)，與鄧佑林等（2021）的試驗結果一致。在所有影響因子中，僅二次項A2、B2、C2對總黃酮含量的變化影響極顯著 （P＜0.01）。從表中F值可知，各因素對總黃酮純化影響大小順序為：上樣速度（B）＞樹脂徑高比（C）＞上樣液濃度（A）。

2.6.3 兩因素間的交互作用 不同因素相互作用影響總黃酮含量的響應曲面如圖2所示。李慧敏等（2018）的研究表明，曲面越陡，表示該因素對總黃酮含量的影響越大。從圖2可以清晰地看出，總黃酮含量的三個響應曲面均開口朝下，與三個影響因子均有明顯的二次拋物關系，上樣液濃度、上樣液吸附速度和樹脂徑高比不斷增加，總黃酮含量逐漸升高，并出現(xiàn)極大值，隨后呈不同斜率的下降，另從方差分析結果與響應曲面觀察可知，AB曲線變化最為密集陡峭，其次為AC，影響最小為BC。對二次拋物線函數(shù)模型進行了極值分析，得到的AB-8大孔樹脂純化藍刺頭總黃酮的最優(yōu)工藝條件為：藍刺頭上樣液總黃酮量6 mg/mL，樹脂徑高比1：8，上樣液吸附速度1 BV/h，洗脫溶劑80%乙醇，純化后總黃酮理論含量為63.9%，實際含量達65%以上，與模型預測值較接近。

圖2 兩因素交互影響總黃酮含量的響應曲面

2.7 乙醇洗脫液濃度的考察 將AB-8大孔樹脂進行預處理，稱取3份（10 g/份），濕法裝柱（φ＝1 cm徑高比1：8），再取6.04 mg/mL藍刺頭上樣液3份（150 mL/份），分別動態(tài)吸附（1 BV/h），接著用純化水4 BV除雜 （2 BV/h），然后分別使用70%、80%、95%乙醇4 BV洗脫（1 BV/h），分別接收水洗液和各濃度乙醇洗脫液，測定其中總黃酮，計算吸附量、比解吸量和解吸率，將各濃度乙醇洗脫液濃縮并干燥得干膏，稱量干膏重，并測定干膏中總黃酮含量，結果如表9所示。

表9 不同濃度乙醇溶液的洗脫情況

從表10結果可知，80%和95%乙醇均能將樹脂所吸附的總黃酮完全解吸，但是95%乙醇洗脫所得的干膏純度較低。

2.8 驗證試驗 取已處理的AB-8大孔樹脂3份（10 g/份），濕法裝柱（φ＝1 cm徑高比1：8），再取6.04 mg/mL藍刺頭上樣液3份（150 mL/份），分別動態(tài)吸附（1 BV/h），接著用純化水4 BV除雜（2 BV/h），然后用80%乙醇4 BV洗脫（1 BV/h），接收水洗液和80%乙醇洗脫液，測定其中總黃酮，計算吸附量、比解吸量和解吸率，將80%乙醇洗脫液經(jīng)過濃縮后進行蒸干，得到干膏，稱量干膏重量，測定干膏中總黃酮含量，結果如表10所示。從表10結果可知，該工藝條件純化所得的藍刺頭總黃酮含量達65%以上，且工藝重復性良好。

表10 驗證試驗結果

3 討論

本試驗中在芹菜苷對照品溶液中加入亞硝酸鈉、硝酸鋁和氫氧化鈉試劑，結果無紅色物質(zhì)產(chǎn)生，在500 nm處也無吸收，說明亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法并不適用藍刺頭總黃酮的測定。李蓮芳等（2017）利用結構中含5-羥基、4-羰基的黃酮類化合物能與三氯化鋁反應形成絡合物的原理來測定大棗中總黃酮的含量；芹菜苷結構中也含相同結構，能使帶I或帶II向紅位移；帶II紅移后對照品溶液與供試品溶液在（275±2）nm處有共同吸收峰，因而可以用三氯化鋁作為顯色劑測定藍刺頭總黃酮的含量。目前，已有較多文獻報道采用三氯化鋁比色法測定植物中的總黃酮含量（孟憲琦等，2021；黃艷萍等，2021；張國權等，2018；劉云鶴等，2017），主要因為三氯化鋁顯色法測定總黃酮結果在誤差范圍內(nèi)準確度較高，顯色反應時黃酮類物質(zhì)反應較強，而對色素、酚酸等非黃酮類物質(zhì)的反應極弱，因而對黃酮類化合物的專屬性較強。本研究中利用三氯化鋁與5-羥基、4-羰基的黃酮或黃酮醇類化合物反應生成絡合物使帶II向紅位移的原理測定藍刺頭總黃酮的含量，測定法經(jīng)方法學驗證重復性、精密度、穩(wěn)定性和準確度較好。

大孔樹脂已被廣泛使用，主要用于進行自然界化合物的分離、富集，如糖苷及其他糖類的分離，在多糖、黃酮類、三萜類和生物堿等化合物的分離精制中，存在著許多的應用案例。藍刺頭中的總黃酮如芹菜素、芹菜苷，其結構中主要含有5，3’-二羥基，易被大孔樹脂直接吸附，不能直接用水洗脫，只能用一定濃度的乙醇溶液洗脫。因此，純化藍刺頭總黃酮時，可以用純化水去除一些高極性雜質(zhì)，如糖、蛋白和黏液質(zhì)，以無色洗脫液為終點，判斷洗脫去除雜質(zhì)的效果。水洗后用高濃度乙醇為洗脫劑，收集所要富集的總黃酮類成分。

本研究共選取了5種不同類型的大孔樹脂，分別考察了它們的吸附性能和解吸特性，選取了性能最佳的AB-8大孔樹脂用于藍刺頭總黃酮的純化。此外，研究過程中考察了藍刺頭上樣液的濃度及其最大上樣體積、上樣液吸附的速度和樹脂徑高比等因素對樹脂吸附藍刺頭總黃酮能力的影響，以及總黃酮純化效果的影響，并篩選出最佳工藝條件。利用最佳工藝純化后的藍刺頭總黃酮的含量超過65%，表明純化效果良好，本研究為藍刺頭的進一步開發(fā)和應用奠定了基礎。