畜禽糞便中抗生素殘留檢測(cè)樣品的前處理技術(shù)及其分析方法研究進(jìn)展

張 薇， 宋艷紅， 趙平偉， 武晉孝， 郭 禹，米彥飛， 劉春龍， 李燕秀， 馮俊吾*

（1.山西省檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山西省標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量技術(shù)研究院，山西太原 030027；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西晉中 030801）

抗生素又稱抗菌素，其是放線菌、細(xì)菌、真菌等微生物的次級(jí)代謝物質(zhì)，也可以通過化學(xué)合成、半合成法制得。在一定濃度范圍內(nèi)抗生素具有殺死或抑制病原菌的作用，所以在預(yù)防以及診斷細(xì)菌疾病方面起了很大的作用。近幾年，可以作為獸用抗菌藥的抗生素廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)。美國每年農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用的抗生素高達(dá)9000～13000 t（王冰等，2007），我國每年大約9.7萬t抗生素被用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)（周啟星等，2007）。畜禽本身只能吸收少量的抗生素，約60%～90%的抗生素隨畜禽糞便排出體外（Halling-sorensen等，1998）。高濃度殘留的抗生素通過廢水及糞肥的施用進(jìn)入土壤和水環(huán)境中，造成水和土壤抗生素污染，還會(huì)影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其活性，導(dǎo)致細(xì)菌出現(xiàn)耐藥性，從而影響抗生素在人類和動(dòng)物的治療效果（Martinez，2008）。因此，許多國家已經(jīng)陸續(xù)成立耐藥監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，比如美國的NARMS、歐盟EARS-Net、加拿大的CIPARS，丹麥的DANMAP以及我國的CARSS系統(tǒng)（羅訊等，2019），并且我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194號(hào)公告規(guī)定，2020年7月1日起，禁止在飼料中添加有促生長用途的獸用抗菌藥（中藥類藥物除外）。

隨著人們對(duì)畜禽糞便中抗生素殘留的危害性越來越關(guān)注，建立和完善畜禽糞便中殘留抗生素的分析測(cè)定方法是研究抗生素各種環(huán)境行為的基礎(chǔ)?，F(xiàn)就畜禽糞便中幾種常見抗生素的種類、作用機(jī)理、樣品前處理方法及相關(guān)檢測(cè)技術(shù)予以介紹，為畜禽糞便中抗生素殘留的控制提供參考。

1 畜禽糞便中常見抗生素的種類

在畜禽養(yǎng)殖過程中被廣泛使用的抗生素，包括大環(huán)內(nèi)酯類、多肽類、氨基糖苷類（Huang等，2011）、四環(huán)素類、磺胺類、喹諾酮類六大類（Ostermann等，2013）。

1.1 四環(huán)素類抗生素 四環(huán)素類抗生素發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)40年代，是由放線菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素，主要包括金霉素、土霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素等。四環(huán)素類抗生素每個(gè)分子中都包含一個(gè)線性熔合的四環(huán)素核。該類化合物為酸堿兩性化合物，在水中溶解度低，易溶于乙醇，在乙酸乙酯、乙腈等有機(jī)溶劑中的溶解度較小。四環(huán)素類抗生素通過阻止細(xì)菌的氨酰轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸與核糖體結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合來阻止菌體蛋白合成從而產(chǎn)生抗菌作用。四環(huán)素類抗生素具有廣泛的抗菌活性，對(duì)多數(shù)革蘭氏陰性菌、陽性菌、衣原體及某些原蟲等有抗菌作用。因其殺菌作用有效和副作用較小被廣泛用于治療人和動(dòng)物的細(xì)菌性感染。

1.2 磺胺類抗生素 磺胺類抗生素是人工合成的抗生素，主要包括磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶等，具有抗菌譜廣、性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。該類化合物為極性物質(zhì)，在極性有機(jī)溶劑中溶解度較大?；前奉惪股氐幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)中有一個(gè)苯環(huán)，一個(gè)磺酰胺基以及一個(gè)對(duì)位氨基，對(duì)位上的游離氨基是抗菌活性部分。對(duì)氨基苯甲酸是葉酸的組成部分，而葉酸又是微生物生長所必需的物質(zhì)?；前奉惪股啬芘c細(xì)菌生長繁殖所必需的對(duì)氨基苯甲酸產(chǎn)生競爭性拮抗作用，從而干擾細(xì)菌的酶系統(tǒng)對(duì)對(duì)氨基苯甲酸的利用產(chǎn)生抑菌作用?；前奉惪股厥谦F用抗生素中使用量最大的抗生素之一。

1.3 氟喹諾酮類抗生素 氟喹諾酮類抗生素是人工合成的一系列含氟的抗生素，具有抗菌活性強(qiáng)、抗菌譜廣、與其他抗生素?zé)o交叉耐藥性以及毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)。主要包括環(huán)丙沙星、氟羅沙星、恩諾沙星、依諾沙星等，其中諾氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星和培氟沙星不允許在食品動(dòng)物中使用。細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶能參與細(xì)菌DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等；拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ在細(xì)菌細(xì)胞壁的分裂中對(duì)細(xì)菌染色體起關(guān)鍵作用。氟喹諾酮類抗生素能抑制以上兩種酶，協(xié)同防止細(xì)菌的復(fù)制而表現(xiàn)出抗菌作用。氟喹諾酮類抗生素作為飼料添加劑被廣泛用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)的疾病防治。

1.4 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是由鏈霉菌產(chǎn)生的廣譜抗生素，具有基本的內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)，可有效抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。主要包括羅紅霉素、泰樂菌素、泰妙菌素、泰拉菌素、替米考星等。細(xì)菌細(xì)胞在蛋白質(zhì)合成的過程中分裂的核糖核蛋白體有兩種亞單位，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素能與其中一種亞單位結(jié)合，抑制肽?；D(zhuǎn)移酶，影響核糖核蛋白的移位過程，阻礙肽鏈的增長，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成從而產(chǎn)生抗菌作用。

1.5 多肽類抗生素 多肽類抗生素是具有多肽結(jié)構(gòu)特征的一類抗生素，主要包括糖肽類抗生素（萬古霉素、去甲萬古霉素和替考拉寧）、多黏菌素類（多黏菌素B、多黏菌素E）和桿菌肽類（桿菌肽、短桿菌肽）。萬古霉素可以與細(xì)菌細(xì)胞壁黏肽的側(cè)鏈終端作用形成復(fù)合物，從而阻斷細(xì)胞壁蛋白質(zhì)的合成。多黏菌素類抗生素環(huán)形多肽部分的氨基與細(xì)菌外膜脂多糖產(chǎn)生靜電作用，破壞外膜的完整性，使藥物的脂肪酸得以穿透進(jìn)去，進(jìn)而增加胞漿膜的滲透性，促使胞漿內(nèi)的磷酸、核苷等小分子外逸，造成細(xì)菌功能障礙直至死亡。桿菌肽是抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成；短桿菌肽是改變細(xì)菌胞漿膜的滲透性。多肽類抗生素的抗菌譜窄，雖然抗菌作用強(qiáng)，但具有不同程度的腎毒性，主要用于治療對(duì)其敏感的多重耐藥菌造成的重癥感染。

1.6 氨基糖苷類 氨基糖苷類抗生素是由氨基糖與氨基環(huán)醇通過氧橋連接成的苷類抗生素，主要包括鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿米卡星等。氨基糖苷類抗生素可影響細(xì)菌蛋白質(zhì)合成的全過程，包括妨礙細(xì)菌合成初始復(fù)合物，誘導(dǎo)其合成錯(cuò)誤的蛋白以及阻抑其釋放合成蛋白，從而產(chǎn)生抗菌性。因?yàn)榘被擒疹惪股貎H對(duì)需氧菌有效，對(duì)厭氧菌無效，所以其主要用于敏感需氧革蘭氏陰性桿菌所致的全身感染的治療。

2 畜禽糞便樣品的提取和凈化

2.1 畜禽糞便中殘留抗生素的提取 目前常用于提取樣品中抗生素的溶劑有甲醇、乙腈等。EDTA-Mcllvaine緩沖液能有效降低抗生素與金屬離子的鏊合，酸化的乙腈有利于提取豬糞便中的抗生素。常用的提取方法有：（1）超聲提取法：借助超聲波的空化效應(yīng)，簡單高效，成本低，在多種物質(zhì)的樣品提取中都有運(yùn)用；（2）振蕩提取法：設(shè)備簡單、便于操作；（3）分散液液微萃?。哼m用于小體積樣品富集分析，簡便有效；（4）加速溶劑萃?。涸诟邷馗邏簵l件下，利用有機(jī)溶劑提取樣品中待測(cè)成分的方法；（5）微波輔助萃取法：利用微波輻射提取固體樣品中的目標(biāo)物，該方法應(yīng)用廣泛，但是不適用于熱不穩(wěn)定性化合物的前處理過程。目前畜禽糞便中殘留抗生素的提取方法主要是超聲提取法和振蕩提取法。

2.2 畜禽糞便中殘留抗生素提取液的凈化 目前，研究者們?cè)趯?duì)樣品提取液中的目標(biāo)藥物富集凈化做了大量的研究。周婧 （2019）分析比較了Waters Oasis HLB（6 mL，500 mg） 小 柱 、Agela Technologies Cleanert PEP（6 mL，500 mg）和Waters PRiME HLB（6 mL，200 mg）三種小柱的凈化效果，結(jié)果顯示HLB柱回收率為50.40%～119.55%；Cleanert PEP對(duì)磺胺類藥物的效果比較好，磺胺類回收率為61.22%～109.42%，但對(duì)其他抗生素回收率不高；PRiME HLB回收率為0%～175.20%。綜合考慮，HLB柱能夠滿足分析要求且穩(wěn)定性較好，原因可能是HLB小柱的填料既有親脂性的二乙烯基苯又有親水性的N-乙烯吡咯烷酮，從而對(duì)不同極性以及酸堿性的目標(biāo)藥物有較好的凈化及濃縮效果。因此，如果所檢測(cè)的目標(biāo)藥物的類別較多、性質(zhì)差異較大，保留容量較大的Waters Oasis HLB柱的效果會(huì)更好。洗脫液要有一定的極性，但是不能太強(qiáng)，避免洗脫下不必要的物質(zhì)，影響提取效果。儲(chǔ)意軒（2018）分別用甲醇和乙腈作為洗脫液進(jìn)行洗脫效果比較，結(jié)果顯示用甲醇洗脫所得的磺胺類和四環(huán)素類七種抗生素回收率均比乙腈高。

QuEChERS （Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）是比較常用的樣品提取和凈化的前處理技術(shù)。糞便樣品經(jīng)過乙腈提取后，鹽析，分散固相萃取成分。該方法準(zhǔn)確，重復(fù)性好，靈敏度高，操作簡單。鄭顏（2021）制備了Fe3O4-MWCNTs復(fù)合材料，為分散固相萃取引入了一種可重復(fù)利用的新型萃取劑。Fe3O4-MWCNTs復(fù)合材料在使用前后沒有明顯的差異，回收率為80%～120%，具有良好的穩(wěn)定性和可重復(fù)利用性，為環(huán)境樣品中其他痕量污染物的檢測(cè)提供參考。這個(gè)方法改進(jìn)了QuEChERS傳統(tǒng)的前處理方法，更加簡便高效。

畜禽糞便基質(zhì)成分復(fù)雜，其中水分約占3/4，固體成分中30%是死細(xì)菌，10%～20%是無機(jī)鹽，10%～20%是脂肪，2%～3%是蛋白質(zhì)，30%是未消化的食物和消化液中的固體成分。研究表明，土壤中有機(jī)質(zhì)含量到4.9%時(shí)就可能吸附獸藥（Amador等，2019），而畜禽糞便中的有機(jī)質(zhì)含量遠(yuǎn)高于4.9%，可能對(duì)獸藥有著更強(qiáng)的吸附力。不同動(dòng)物的糞便具體成分也不一樣。雞糞便通常比豬糞便含有更多的金屬離子，四環(huán)素類抗生素易與金屬離子鰲合，導(dǎo)致其不能被完全提取。豬糞便比雞糞便含有更多的纖維素和生物絮凝體，其中可能包埋或者吸附殘留的抗生素（費(fèi)輝盈等，2006）。這些因素都可能影響抗生素的提取效率。另一方面，提取液中的雜質(zhì)過多不僅會(huì)影響抗生素的檢測(cè)結(jié)果，而且會(huì)縮短儀器的使用壽命。因此，樣品前處理技術(shù)成為畜禽糞便中抗生素殘留檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵。目前常用前處理方法見表1。

表1 畜禽糞便前處理方法

3 抗生素檢測(cè)方法

最早應(yīng)用于抗生素檢測(cè)的方法是生物學(xué)方法，但是生物學(xué)的方法耗時(shí)較長，并且靈敏度很低。目前，用于抗生素殘留檢測(cè)的方法主要有高效液相色譜及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 （Amador等，2019）。

3.1 高效液相色譜法 高效液相色譜以液體作為流動(dòng)相，極性不同的單一溶劑或者比例不同的混合溶劑、緩沖液等通過高壓泵輸入作為固定相的色譜柱中。各成分在柱內(nèi)被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)高效液相色譜也具有較好的分離效果，并能準(zhǔn)確的定性定量分析，因此在抗生素殘留檢測(cè)中應(yīng)用廣泛。表2為高效液相色譜法檢測(cè)畜禽糞便中抗生素殘留的方法匯總。

表2 高效液相色譜法檢測(cè)畜禽糞便中抗生素殘留的方法匯總

3.2 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 高效液相色譜與高選擇性、高靈敏度的串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合可以克服背景干擾，對(duì)復(fù)雜樣品仍可達(dá)到很高的靈敏度，是畜禽糞便抗生素殘留檢測(cè)方法研究的重要方向。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜既結(jié)合了液相色譜對(duì)復(fù)雜基質(zhì)的高分離能力又有質(zhì)譜獨(dú)特的靈敏度、選擇性、相對(duì)分子質(zhì)量以及結(jié)構(gòu)性，對(duì)復(fù)雜基質(zhì)可以進(jìn)行更準(zhǔn)確的定性、定量分析，適合殘留抗生素的痕量檢測(cè)。表3為液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)畜禽糞便中抗生素殘留的方法匯總。

表3 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)畜禽糞便中抗生素殘留的方法匯總

4 結(jié)論與展望

目前常用的的畜禽糞便中抗生素殘留的檢測(cè)方法存在前處理過程繁瑣、實(shí)驗(yàn)成本高、便捷性較差等問題。因此要想滿足畜禽糞便中抗生素殘留檢測(cè)的實(shí)際需要，一方面要研究新的抗生素檢測(cè)方法，以期找到更為簡便、精確的檢測(cè)方法；另一方面需要對(duì)現(xiàn)有方法進(jìn)行優(yōu)化，提高實(shí)用性和可操作性，還要進(jìn)行快速篩選方法以及高通量確證方法的研究。高效毛細(xì)管電泳法是以毛細(xì)管作為分離通道，高壓電場作為驅(qū)動(dòng)力，根據(jù)供試品中各個(gè)組分之間的淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離。毛細(xì)管電泳技術(shù)不僅有高壓電泳及高效液相色譜的優(yōu)點(diǎn)，而且儀器簡單，易自動(dòng)化，分析速度快，效率高，操作模式多，開發(fā)方法容易，消耗少，在畜禽糞便中殘留抗生素的快速檢測(cè)中具有很大應(yīng)用潛力。