帕金森病的外周血標志物研究進展

任煒霞 劉 毅 蔡 麗 武前福

生物學標志物被定義為“客觀測量和評估的特征，作為正常生物過程、致病過程或對治療干預的藥理學反應的指標”。其可以是臨床的(如客觀測量的體格檢查結果)，可以是基于成像的(如 MRI 上特定大腦區域的顯像)，也可以是遺傳的(如基因型作為疾病發生的預測因子)。此外，生化指標也成為了生物學標志物的潛在候選者，這些生化生物學標志物可以來自腦脊液、血液成分、尿液和皮膚等。考慮到外周血檢驗的可及性、微創性和低成本性，基于血液的生物學標志物被視為一種理想的可選擇途徑。無偏移的生物學標志物發現方法包括蛋白質組學、代謝組學和基因表達譜3種。其中，蛋白質組學廣義上被定義為對許多蛋白質的結構和功能的大規模研究；代謝組學(或稱代謝組學分析)是對化學代謝過程的深入研究，繼而反映于低分子代謝物的測量中；而基因表達譜的研究主要依賴于微陣列，涉及核酸樣品與大量寡核苷酸探針的雜交，其可以測試給定樣本中數千個基因的平行表達，并且全基因組表達的變化為生物學標志物的發現可做出重要貢獻[1]。本文將主要從以上3個方面出發，討論部分重要的帕金森病(Parkinson′s disease,PD)外周血生物學標志物的研究現狀，為 PD 生物學標志物的發掘提供理論依據與創新思路。

一、蛋白組學

1.α-突觸核蛋白(alpha-synuclein，α-syn)：α-syn是 PD 定義的神經病理學病變——路易體中包含的主要蛋白質，被認為是 PD 的重要病理產物，其在體內(主要為腦脊液)含量的高低與患者臨床癥狀的嚴重程度密切相關。大量實驗證據表明，在嚙齒動物和猴子的黑質中施用人 α-syn 或慢病毒或攜帶重組腺相關病毒的野生或突變人 α-syn 基因可導致 PD 的進行性進展[2]。不少關于 α-syn 在腦脊液和血漿中的鑒定性研究提供了它是由細胞分泌的證據。其中腦脊液中 α-syn 作為PD診斷性生物學標志物的研究努力已經取得了一些希望，而基于血液中 α-syn 生物學標志物尚需進一步探索。已有研究發現，α-syn在血液中的濃度遠高于腦脊液，這或可表明腦脊液的血液污染可能是一個嚴重的問題[3]。在一項研究中，Shi等[4]通過注射放射性標記的 α-syn 進入小鼠大腦，發現腦脊液 α-syn 很容易被運輸到血液中，PD患者的血漿外泌體 α-syn 水平顯著升高。此外，該研究還發現，血漿外泌體 α-syn 的診斷敏感度和特異性與腦脊液α-syn測定的診斷敏感度和特異性相當。此外，不少研究證實，α-syn作為PD的關鍵病理成分，與先天性和適應性免疫系統的激活有關。Williams等[5]通過實驗發現，來自PD患者的外周循環 CD4 和 CD8 T 細胞可產生 Th1/Th2 細胞因子以響應α-syn，同時 CD4 缺陷小鼠可以免受由于α-syn過度表達導致的多巴胺能細胞損失，這表明 PD 可能存在慢性記憶T淋巴細胞反應。除此之外，也有報道稱α-syn與其他病理性蛋白的相互作用也會導致突觸功能障礙，從而促使 PD 的進一步發展，SNARE蛋白便是其中之一[6]。

2. DJ-1：除了α-syn外，DJ-1也被認為是PD診斷和(或)監測疾病進展的主要生物學標志物。它是一種多功能蛋白，在氧化應激、細胞死亡和突觸核蛋白病(包括PD)中扮演著重要角色。有研究結果顯示，與對照組比較，PD患者腦脊液中的總 DJ-1 水平降低[7]。為了證明血漿中 DJ-1 的水平與 PD 的相關性，探索 PD 外周生物學標志物，Lin等[8]在一項針對119例受試者的初步研究中檢測到了7種DJ-1同種型，并且發現具有4-羥基-2-壬烯醛修飾的患者血液水平在晚期PD中發生了改變，由此證明了 DJ-1 與 PD 在一定程度上的相關性。另外，Shi等[9]使用改良的多重免疫測定法研究了來自126例 PD 患者和122例正常對照的樣本，據報道，與 ELISA 和蛋白質印跡比較，該方法表現出更高的敏感度。此外，該研究還評估了各種因素的影響，包括溶血、血小板污染和年齡依賴性，結果顯示血紅蛋白和 DJ-1 之間呈正相關，并發現超過95%的血漿 DJ-1 和 α-syn 均來自紅細胞，且隨著 PD 患者的年齡增長，檢測到的 DJ-1 值顯著下降。但PD和正常對照組在 DJ-1 或 α-syn 的血漿水平比較，差異無統計學意義，這表明它們尚不能用作 PD 診斷和(或)預后的生物學標志物，因此需要進一步驗證。但是該研究中開發生物學標志物過程中，重要的質量控制步驟為后續研究提供了一定的技術指導[1]。

3.載脂蛋白Α1：載脂蛋白A1是一種多功能載脂蛋白，在人體生理學中具有多種作用，包括調節炎癥和膽固醇轉運等，且具有抗氧化和抗炎特性，在神經退行性疾病的診斷與預防方面有著重要價值[10]。有研究發現，與健康受試者比較，HY Ⅱ期和Ⅲ期PD患者聚類蛋白、補體C1r亞組分和載脂蛋白A1的表達水平顯著降低。其中，與HY Ⅱ期比較，HY Ⅲ期PD患者載脂蛋白A1水平明顯降低，且其水平與 PD 的進展具有相關性[11]。另一項研究通過對624例 PD 受試者的基線血清中載脂蛋白A1的測量以及前瞻性隊列分析，證明載脂蛋白A1與以 PD 為主的嚴重運動和非運動疾病表型顯著相關[12]。Qiang等[13]在152例 PD 患者的隊列研究中發現，通過多重免疫測定法測量了96種蛋白質的血漿水平，并通過線性回歸確定與 PD 發病年齡相關的蛋白質，篩選出最佳候選載脂蛋白A1，并證明低水平的載脂蛋白A1 與早期 PD 發作相關。基于既往研究，載脂蛋白A1 被鑒定為 PD 風險的潛在標志物。

4.S100B：S100B是一種Ca2+結合蛋白，主要集中于星形膠質細胞中，它在腦脊液、外周血等體液中的水平被認為與神經退行性疾病密切相關，可作為監測疾病趨勢的重要輔助手段[14]。在 PD 的發病機制中，S100B 的過度生產和釋放起著至關重要的作用，以響應紋狀體多巴胺能去神經支配或6-羥多巴胺[15]。有研究發現，在 PD 患者的黑質紋狀體中存在著S100B過表達現象[16]。此外，也有報道稱，過表達S100B的轉基因小鼠可出現 PD 的特征性表現，如運動協調能力受損和一些分子包括多巴胺-d2受體的產生。S100B基因敲除小鼠與可以模擬 PD 的神經毒性物質1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)處理的野生型小鼠比較，MPTP 處理減少了多巴胺能神經元的損失和小膠質細胞增生；同樣地，使用arundic酸抑制星形細胞S100B的合成可保護小鼠多巴胺能神經元免受 MPTP 毒性[17]。

除了以上幾種蛋白生物學標志物外，還有一些研究也發現了其他可作為 PD 外周血的蛋白組學生物學標志物。Posavi等[18]從大約1000種血漿蛋白的無偏篩選開始，研究了發現-復制設計中的多個隊列，從中篩選出4個關鍵性候選生物學標志物——氨酰化酶1(aminoacylase 1，ACY1)、骨唾液酸蛋白(bone sialic acid protein，BSP)、生長激素受體(growth hormone receptor，GHR)和骨調節蛋白(bone regulatory protein，OMD)，并證明 ACY1 和 GHR 的基線水平與隊列中的認知下降率相關。α-syn 有兩大降解途徑，即自噬-溶酶體途徑和泛素蛋白酶途徑，因此通過對這兩大途徑中相關蛋白的研究，或可成為發現 PD 生物學標志物的一個重要方向。在自噬-溶酶體途徑中，α-syn的降解主要依賴于分子伴侶介導的自噬和巨自噬。Juhee等[19]通過對 PD 患者血漿樣本的定量分析，發現其athanogene 2(一種Hsp70/Hsc70分子伴侶相互作用蛋白)和組織蛋白酶D(一種主要溶酶體蛋白酶，直接參與α-syn的降解)水平顯著降低，該研究為此二者成為早期診斷 PD 的血漿生物學標志物提供了可能性。

二、代謝組學

1.尿酸：尿酸在 PD 病理生理學中被提出是基于推論的尿酸抗氧化特性、PD 患者黑質中發現的低水平尿酸以及尿酸降低多巴胺氧化能力的相關性。早期研究表明，低血漿尿酸水平是 PD 的危險因素，并且尿酸與鐵結合蛋白有關。尿酸作為一種生物學標志物的潛力首先是通過對參加檀香山心臟計劃的7968例男性的尿酸水平和發生 PD 的風險進行分析而展開的。在該隊列中，在基線和超過30年的隨訪中獲得了血清尿酸水平，其中92例男性發展為特發性 PD。在調整年齡或吸煙史后，基線時尿酸濃度高于中位數的男性與低于中位數的男性比較，PD發生率降低了40%。該研究提供了尿酸與 PD 發生率之間關聯的前瞻性證據，并表明有必要對這種關聯進行進一步調查[20]。此外，一篇關于尿酸與 PD 聯系的系統評價共分析了1104例患者的數據，試圖揭示血清尿酸濃度與一些 PD 非運動癥狀類型之間的相關性，結果顯示睡眠與疲勞、注意力與記憶的相關性最大。但是遺憾的是，該研究表明血清尿酸水平與 PD 中非運動癥狀的發生和惡化之間的相關性無法明確化，可能與尿酸水平本身是一種易受多種因素影響的生物學標志物有關，因此需要對更多樣化的患者群體、運用更準確的 PD 非運動癥狀評估方法進行大規模研究[21]。

在此基礎之上，有研究已開始評估尿酸水平是否會在 PD 的遺傳形式中發生變化。為了探索存在葡萄糖腦苷酸酶(glucocerebrosidase，GBA)基因突變的 PD 患者、散發型 PD 患者和縱向隨訪的健康對照組血清尿酸水平的差異。Koros等[22]從 PD 進展標志物倡議(Parkinson′s disease progression marker initiative，PPMI)數據庫中下載了120例 GBA-PD 患者2年的血清尿酸測量數據，該隊列與369例偶發 PD 患者和195例健康對照者進行了比較。結果表明，校正年齡、性別和體重指數(body mass index，BMI)后，與對照組比較，GBA-PD 隊列的2年縱向尿酸水平較低；基線尿酸測量結果顯示僅有微小差異，但在 GBA-PD 隊列中，第2年的尿酸水平較低。這是在 GBA-PD 隊列中評估血清尿酸的研究，該研究結果證實低血清尿酸可能是 GBA-PD 進展的一個生物學標志物。然而，關于低血清尿酸與 GBA-PD 臨床數據之間的關系還需要更多的研究。另有報道指出，鐵死亡或為PD的重要發病機制之一。

為了檢測 PD 患者和健康對照者的血漿尿酸水平和外周鐵代謝標志物，Garrido等[23]對40例 PD 患者和29例對照者進行了臨床篩查和實驗室測試，結果顯示，患者的血漿尿酸水平明顯低于對照組，血漿鐵參數水平比較，差異無統計學意義，但血漿尿酸水平與患者和對照者的血清鐵蛋白密切相關。該研究對 PD 的發病機制提供了建議，也為尿酸成為PD外周標志物的確定提供了依據。

2.谷胱甘肽(glutathione，GLU)：氧化還原應激是 PD 病理生理學的重要表現之一，總谷胱甘肽由還原型 (GSH)和氧化型 (GSSG)組成，對于維持氧化還原穩態、清除代謝廢物以及作為中樞神經系統中氨基酸的儲存庫起著至關重要的作用[24]。1982年有研究提出GSH缺乏在 PD 中起致病作用。為了進一步描述 PD 個體 GLU 狀態的中樞和外周測量，并評估 GLU 狀態是否與 PD 嚴重程度相關，Mischley等[25]通過研究發現， GLU的血液測量值隨著年齡的增長而下降，且血液 GLU 濃度越低，統一PD評定量表(unified Parkinson′s disease rating scale，UPDRS)和患者報告的 PD 結果(patient-reported PD，PRO-PD)分數越高(癥情越嚴重)。這些結果表明，全血 GLU 可能具有作為 PD 生物學標志物的潛力，未來的研究可致力于評估它是否為PD 進展的可改變風險因素。

針對GLU與 PD 的相關性，已經有研究從治療方面入手，探索GSH療法對疾病的改善作用。Coles等[26]在 PD患者和健康對照者中進行了一項開放標簽、前瞻性研究，口服4周高劑量N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC，一種抗氧化劑和谷胱甘肽前體)。NAC的主要作用機制是被假設通過去乙酰化產物半胱氨酸(cysteine，Cys)發生。4周的高劑量口服 NAC 方案導致 Cys、血液抗氧化物質GSH/GSSG 和過氧化氫酶顯著增加。該研究還提示NAC 不會增加 GSH 腦濃度，而且一些 PD 患者的癥狀在使用高劑量 NAC 后會隨著治療的停止而惡化。由于樣本量較小等局限性，該實驗結果未能檢測到大腦任何部位的化學物質變化，但是為未來的大樣本量、多部位、多給藥途徑、治療時間以及尋找最佳生物學標志物和選擇監測方法提供了一定的參考。

三、基因表達譜

1.GBA基因：PD發生的一個重要危險因素為遺傳，研究指出，其在 PD 的發病因素中占比不低于27%，目前在真核生物和哺乳動物中發現了大量 PD 相關基因，其中編碼溶酶體酶葡萄糖腦苷脂酶(glucocerebrosidase，GCase)的 GBA 突變被認為是 PD 發病的常見遺傳風險因素，其發生于7%～15%的 PD 患者中，使患病的風險增加了5%～25%[27]。有研究通過比較具有和沒有GBA突變的PD患者血漿中的 α-syn 水平、GCase 相關的溶酶體整合膜蛋白-2(lysosomal integration membrane protein-2，LIMP-2)來定義 GBA 基因相關 PD 的生化特征。其外周血單核細胞(peripheral blood monocyte，PBMC)的測量結果顯示，與非突變 PD 比較，GBA 突變的PD患者表現出更高的 α-syn 水平、更低的 GCase 活性和更高的 LIMP-2 水平[28]。有一項研究已證明，通過對GBA基因雜合子 c.1226A >g (p.N370S) 突變患者 PBMC 重編程，獲得 ICGi034-A 誘導的多能干細胞(iPSC)系，以此可用于研究 GBA 相關 PD 的基本發病機制以及潛在的藥物篩選，為 GBA 基因提供了新的研究方向[29]。

2.環狀RNA (circRNA)：多項研究揭示了神經退行性疾病中存在明顯的circRNA失調。考慮到 circRNA 具有以下特性：①穩定性；②不會像蛋白質一樣被修飾，因此水平與活性直接相關；③可以通過快速和常規的實驗室方法準確量化。這3種特性為其成為優秀的候選生物學標志物提供了有利的研究條件。為了鑒定 PD 患者的 PBMC 中差異表達的腦富集 circRNA，Ravanidis等[30]通過研究發現，與健康對照受試者比較，從 PD 患者獲得的PBMC中，有6個circRNA 發生了顯著變化，即MAPK9_circ_0001566、HOMER1_circ_0006916、SLAIN1_circ_0000497、DOP1B_circ_0001187、RESP1_circ_0004368和PSEN1_circ_0003848 在 PD 隊列中均被下調，且 PD 患者組比健康對照組平均下降了17%。此外，有研究使用外周血中的RNA 測序發現大量 circRNA 在 PD 患者和正常對照組之間差異表達，其中包括129個上調的circRNA,282個下調的 circRNA。通過使用京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)數據庫進行分析，結果顯示第二富集的 KEGG 途徑即為PD。此外，circRNA 譜表明 PD 發病機制可能與氧化反應和止血途徑有關。這些數據均可證明外周血中 circRNA 的水平可能被用作 PD 的生物學標志物。

3.microRNA(miRNA)：越來越多的證據表明，神經變性疾病中存在miRNA 的失調，這開啟了對血液或其他生物體液中 miRNA 的循環水平進行表征的研究道路，也為其用作非侵入性診斷性生物學標志物篩選開發了潛能，用以支持早期疾病檢測和可能的疾病進展監測。據報道，人類的 α-syn 基因在整個 3′-非翻譯區高度保守，這與 miRNA 的調節作用相關。特別是已發現 α-syn 是miR-7 和 miR-153的靶標。這兩種 miRNA似乎通過與 α-syn 的 3′-非翻譯區結合而借助協同作用以下調α-syn的 mRNA 和蛋白質水平。這一觀察也得到了體外研究結果的支持，其中 miR-7 被描述為抑制神經元培養物中α-syn誘導的細胞毒性物。

此外，有研究對7例PD患者通過電刺激誘導的腦深部電刺激治療前后的血液白細胞中獲得的 miRNA 進行了評估，并將結果與通過下一代小 RNA 進行全面 miRNA 分析后的6例健康對照受試者的結果進行了比較測序和外顯子及剪接點微陣列。結果顯示，與對照組比較，PD 患者中有16種 miRNA 存在差異表達，其中11種 miRNA 的表達模式通過腦深部電刺激進行了修飾。而且在通過電刺激改變的這11種 miRNA 中，有5種(miR-1249、miR-20a、miR-18b、miR-378c、miR-4293)與健康對照組中存在的相匹配，這表明PD-miRNA模式在刺激后逆轉為健康個體的模式，為 PD 提供了一種可能的治療途徑。

在另一項關于 miRNA 參與 PD 病因的研究中，研究者使用微陣列對從19例PD患者和13例健康對照獲得的PBMC進行 miRNA 表達譜分析。結果顯示，與對照組比較，18種 miRNA 在 PD 患者中差異表達。此外，進行染色質免疫沉淀測序分析以揭示 α-syn 的全基因組相互作用，并將這些數據與 miRNomics 數據以及計算機數據合并對 PD 相關基因的分析表明，鞘糖脂生物合成途徑以及蛋白質泛素化途徑是 PD 疾病進展的關鍵因素，并且發現有3種 miRNA 是這兩種重要生物學途徑的主要調節因子，即 miR-26a、miR-30b 和 miR-30c，其中兩個基因(ST8SIA4和USP37)與 PD 發病機制相關。以上研究均可為 miRNA 成為 PD 潛在的診斷性生物學標志物提供可能。

4.G2019S LRRK2：富含亮氨酸重復激酶2(leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2)突變是導致 PD 的常見基因突變，且 G2019S LRRK2 或其他 LRRK2 致病突變的非表現攜帶者患 PD 的風險隨著年齡的增長而增加。為了確定 G2019S 突變型選擇性 LRRK2 激酶抑制劑與非選擇性抑制劑在遺傳性和特發性 PD 受試者血液中對兩種 LRRK2 生物學標志物 pSer935 LRRK2 和 pThr73 Rab10 的活性，研究者從13例患有或不患有 PD 的 G2019S LRRK2 突變的受試者和1例健康對照者身上采集血液，用新型 G2019S LRRK2抑制劑(EB-42168)或非選擇性抑制劑MLi-2離體處理PBMC，進行定量蛋白質免疫印跡分析。結果表明，與野生型 LRRK2 比較，EB-42168 對 G2019S LRRK2 的選擇性高100倍。該研究證明，G2019S LRRK2 選擇劑EB-42168以基因劑量依賴性方式降低人PBMC中pSer935 LRKK2和Thr73 Rab10的磷酸化，同時證實 G2019S 選擇性抑制劑可以有效降低與致病性 G2019S LRRK2 相關的生物學標志物活性突變。

另有研究使用來自西班牙的 LRRK2隊列的PBMC庫進行了一項蛋白質組學研究，在將所有G2019S攜帶者與健康對照進行比較時，發現了與G2019S突變狀態相關的特定蛋白質差異。G2019S LRRK2相關PD(L2PD)和G2019S LRRK2非表現攜帶者(L2NMC)組的蛋白質差異獨立地高于所有G2019S攜帶者，據此可初步說明PD和非PD G2019S攜帶者中存在特異性蛋白質磷酸化差異，為PD早期診斷的生物學標志物的發現提供了LRRK2靶向試驗。雖然這些發現需要進一步證實，但它們證明了基因表達譜在識別基于血液的PD生物學標志物方面的潛在效用。

四、展 望

大量研究團體致力于探索開發 PD 生物學標志物的新方法，到目前為止，已經發現了許多候選的生物學標志物。生物學標志物作為正常生理或病理過程的指標，是疾病機制的重要反應物。鑒于疾病病因和病理的復雜性，更全面地識別特定疾病網絡和分子途徑將有助于更好地了解疾病過程并找到更有效的生物學標志物。到目前為止，仍沒有公認的明確的 PD 生物學標志物，出于兩個原因，迫切需要開發早期診斷的生物學標志物：①在疾病早期進行干預；②探索可能延緩疾病進程的治療干預。鑒于樣本采集的便利性，PD 中基于血液的生物學標志物發現具有高度的研究優先性。近年來，蛋白質組學、代謝組學和基因表達譜等工具已趨于成熟，并被廣泛應用于 PD 生物學標志物的研究。基于技術的完善和研究者的探索，已經提出了許多有前途的生物學標志物，或可為 PD 的早期診斷和治療提供可能的檢測手段。

在不斷研究、探索過程中尚且存在一些不可忽視的問題：(1)基于血液的生物學標志物開發存在著一些挑戰。很顯然，大腦和外周血之間沒有直接連接(特別是在完整的血-腦脊液屏障的情況下)。此外，血液可以被概念化為由血漿、血清和細胞區室組成，是細胞、蛋白質、脂質和各種代謝產物的異質混合物，在研究過程中還需考慮血液成分對生物學標志物水平的綜合影響，這意味著很難將外周生物學標志物確定化，因此需要不斷的技術更新和大量的研究驗證。(2)理想的生物學標志物仍然難以捉摸。眾所周知，生物學標志物在疾病過程的不同階段扮演著不同的角色，而且各種生物學標志物水平又因人而異，因此單一的生物學標志物可能不足以早期診斷疾病，也無法以足夠的敏感度或特異性預測疾病進程。在今后的探索道路中，使用由生物樣本、臨床特征、神經影像學和遺傳信息組成的綜合生物學標志物數據集開發組合方法，聯合不同的生物學標志物，以提高 PD 的診斷準確性、敏感度和特異性，或可成為發掘 PD 生物學標志物的重要方法。