益腎骨康方對肺癌A549細胞形態及轉錄組基因表達的影響

何理玉 楊夢霞 蘆殿榮 馮 利

(1 中國中醫科學院望京醫院,北京,100102; 2 國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫學研究中心/中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院,北京,100021)

肺癌是癌癥相關死亡最常見的原因,2018年全世界約有209萬人被診斷為肺癌,176萬人死于肺癌。我國癌癥統計數據顯示2015年新發肺癌病例73萬例,死亡病例61萬例。肺癌患者的5年生存率根據分期和地域差異在4%～17%之間變化[1-2]。肺癌發病率和死亡率隨著年齡增長而上升。伴隨我國人口老齡化、工業化發展導致的大氣和環境污染以及煙草流行率全球最高,我國肺癌發病率和死亡率將會進一步攀升[3-4]。臨床上肺癌的治療采用多學科綜合治療的原則,具體手段包括手術、放療和化學治療,以及靶向、免疫、生物治療等。西醫治療惡性腫瘤占主流地位,但存在瓶頸且尚未突破。中醫根據整體觀和辨證論治對惡性腫瘤及其并發癥的治療具有獨到的見解。益腎骨康方(專利號:ZL2013 1 0582907.9,專利權人:馮利)是馮利教授根據中醫理論治療惡性腫瘤骨轉移癌痛研制而成的處方,臨床及基礎研究驗證有效。前期細胞實驗研究發現益腎骨康方可以抑制肺癌A549細胞的增殖、遷移等[5]。本研究擬用益腎骨康方干預,通過電鏡觀察腫瘤細胞表面形態的改變以及通過轉錄組基因測序探討益腎骨康方作用于肺癌A549細胞的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人肺腺癌A549細胞株由中國中醫科學院望京醫院骨傷科研究所藥理室惠贈。

1.1.2 藥物 益腎骨康方中藥購自中國中醫科學院望京醫院門診中藥房,中藥飲片加水浸泡30 min,煎成60 mg/mL的中藥母液,濾網過濾后,用0.22 μm孔徑的針筒式微孔濾膜過濾器過濾,混勻,分裝,放入-80 ℃冰箱保存備用。使用時將中藥母液溶于RPMI1640無血清培養基中配置成4.18 mg/mL中藥干預濃度。

1.1.3 試劑與儀器 RPMI1640基礎培養基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素混合溶液、0.25%胰蛋白酶消化液(北京索寶萊科技有限公司,貨號分別為10491、11011-8611、P1400、T1300);Trizol(ambion公司,美國,貨號:15596026)。TC處理96孔圓形細胞爬片(上海臥宏生物科技有限公司,貨號:LY-14-TC)。細胞培養箱(Thermo公司,美國,型號:Forma 370);倒置光學顯微鏡(麥克奧迪實業集團有限公司,型號:Motic AE2000);離子濺射儀、掃描電鏡(HITACHI公司,日本,型號分別為:E-1010、S-3400N)。

1.2 方法

1.2.1 電鏡 將TC處理的96孔圓形細胞爬片(直徑3 mm)放置于96孔板。將生長狀態良好的A549細胞,消化,離心(1 000 r/min,離心半徑13.5 cm),調整細胞懸液濃度為8×104個/mL,接種于帶有爬片的96孔板中,待細胞長滿爬片80%左右,分2組給藥:對照組,即用不含中藥的基礎培養基培養細胞;益腎骨康方組,即用含中藥4.18 mg/mL的基礎培養基培養細胞。24 h后,棄去培養液,將爬片放置于24孔板,PBS洗2遍,每孔加入1.5 mL 2.5%戊二醛固定液固定,4 ℃冰箱過夜,磷酸鹽緩沖液漂洗3遍,1%OsO4固定45 min,磷酸鹽緩沖液漂洗3遍,脫水∶丙酮∶醋酸異戊酯(1∶1)10 min,醋酸異戊酯0.5 h,臨界點干燥,離子濺射儀噴金,分別于掃描電鏡2.00 k、5.00 k放大倍數下觀察、拍照。

1.2.2 轉錄組基因測序

1.2.2.1 差異基因篩選 該研究分為益腎骨康方組和對照組2組分別干預肺癌A549細胞,24 h后檢測mRNA的表達情況。具體操作步驟為RNA提取、檢測、mRNA富集、雙鏈cDNA合成、末端修復(加A和接頭)、片段選擇和PCR擴增、文庫檢測、Illumina上機測序、數據指控和基因表達水平定量等。使用DESeq2 R軟件進行益腎骨康方組和對照組2組之間的差異表達分析(每個組2個生物學重復)。通過DESeq2發現調整的P值<0.05的基因被分配為差異表達的。使用Benjamini&Hochberg方法調整P值。校正后的P值以及|log2foldchange|作為顯著差異表達的閾值。

1.2.2.2 差異基因富集分析 通過clusterProfiler R軟件實現差異表達基因的基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析,其中修正了基因長度偏差。考慮具有<0.05的校正的P值的GO term通過差異表達基因顯著富集。京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)是一個數據庫資源,用于從分子水平的信息,特別是基因組測序產生的大規模分子數據集和其他高通量數據庫中了解生物系統的高級功能和效用,如細胞,生物體和生態系統等。我們使用clusterProfiler R軟件分析KEGG通路中差異表達基因的統計富集。

1.2.2.3 差異基因蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網絡分析 Cytoscape 3.6.0是一個生物信息學軟件平臺,用于可視化分子交互網絡,通過該軟件構建PPI網絡圖;MCODE(Version 1.4.2,Bader Lab,University of Toronto)是一個能對構建的生物學網絡進行關聯度分析的插件,根據關聯積分值,可獲得整個網絡中可能形成的蛋白質簇和關鍵節點蛋白,并在Cytoscape軟件中進行可視化顯示。選取標準如下:MCODE評分>5,度截止為2,節點分值截止為0.2,k分值等于2。

2 結果

2.1 A549細胞表面的形態變化 A549細胞在正常情況下形態為梭形和多角形。對照組細胞形態正常,飽滿,表面有膜皺,絲狀偽足。益腎骨康方組可見細胞表面膜皺顯著減少,絲狀偽足斷裂,凋亡小體形成。細胞皺縮和凋亡小體的形成是細胞凋亡的特征。絲狀足是一種較薄的細胞質突起,在細胞附著到生長表面、協助細胞遷移等方面起著重要作用,是細胞與細胞連接的重要組成部分。見圖1。

圖 1A549細胞表面形態變化的掃描電鏡觀察(×6 000)

2.2 轉錄組基因測序

2.2.1 差異基因篩選 益腎骨康方組和對照組的基因表達情況,2組比較矯正Pvalue<0.05,|log2FoldChange|>1的差異表達基因有440個,其中下調基因有136個,上調基因有304個,其中與益腎骨康方抑制腫瘤細胞作用關系密切的基因為SOX2,SOX2在益腎骨康方組中表達下調。差異基因火山圖見圖2。

2.2.2 GO和KEGG富集分析 在GO功能富集過程中共得到307條結果,主要涉及生物過程(237項)、細胞組分(56項)和分子功能(14項)。在生物過程中,主要包括外源性凋亡信號通路、轉移酶活性

圖2 差異基因火山圖

的負調節等;在細胞組分中,主要包括黏著連接、細胞-基質連接、細胞-基質黏附連接等;在分子功能中,主要包括細胞黏附分子結合、鈣黏蛋白結合參與細胞黏附、細胞-細胞黏附遞質活性等。從GO富集分析結果中,選取最顯著的30個Term繪制散點圖。見圖3。將分析條件設為錯誤發現率(FDR)<0.05,分別在生物過程、細胞成分和分子功能方面篩選出前10個顯著富集的條目。KEGG通路分析,與益腎骨康方抑制肺癌A549細胞的作用相關機制主要涉及細胞凋亡方面。從KEGG富集結果中,選取最顯著的20個KEGG通路繪制散點圖進行展示。見圖4。

圖3 益腎骨康方組與對照組差異表達基因的 GO功能富集分析

圖4 益腎骨康方組與對照組差異表達基因的 KEGG功能富集分析

2.2.3 PPI網絡 PPI網絡包含290個節點和743條邊。通過MCODE插件篩選出核心基因,根據Degree值篩選出與益腎骨康方生藥抑制肺癌細胞增殖和轉移關系密切的2個基因:MMP9和CCL2,節點度(Degree)分別為36和27。益腎骨康方高劑量組與對照組比較下調了MMP9和CCL2基因的表達。見圖5。

圖5 與中藥抑制腫瘤轉移相關的差異表達基因蛋白互作網絡圖

3 討論

中醫藥是我國的民族瑰寶,我國中藥資源豐富,價格相對低廉,尋找有效的抗腫瘤中藥是研究的熱點。中藥有效成分及復方抗肺癌機制包括抑制細胞生長、增殖、遷移、黏附、侵襲以及誘導細胞凋亡、自噬等方面,其內在機制多為可調節多個分子、通路及基因水平的物質[6]。益腎骨康方具有補腎健脾,解毒化瘀,滲濕消腫,抗癌止痛的功效,該處方中包含多味中藥單體,現代藥理學研究發現均具有抗腫瘤作用。課題組前期細胞實驗研究也發現益腎骨康方可以抑制肺癌A549細胞的增殖、遷移等。

本研究通過掃描電鏡發現益腎骨康方作用于A549細胞24 h后,促使A549細胞表面的膜皺減少、絲狀偽足斷裂及凋亡小體形成,從而降低了A549肺癌細胞轉移活性以及誘導癌細胞發生凋亡[7-9]。

通過GO功能富集分析發現與益腎骨康方抑制肺癌A549細胞的作用機制相關的差異表達基因主要涉及細胞黏附和外源性凋亡信號通路等。通過KEGG通路分析顯示與益腎骨康方抑制肺癌A549細胞的作用機制相關的通路主要涉及到細胞凋亡方面。

本研究通過比較益腎骨康方組和對照組,我們篩選出差異倍數至少2倍(|log2FoldChange|>1)且具有統計學意義的差異表達基因,共440個。通過查閱文獻我們得到了一個與癌癥密切相關的基因SOX2,它在益腎骨康方組中表達下調。Y染色體性別決定區域盒2(Sex Determining Region Y-box 2,SOX2)屬于SOX(SRY樣高速泳動族蛋白盒)基因家族成員,是干細胞核心轉錄因子,參與維持干細胞的多能性、增殖、自我更新、多向分化及重新編程等[10-11]。多項研究提示SOX2基因突變、甲基化或表達異常與多種癌前病變及腫瘤的惡性生物學行為有關[12-14],同時有研究顯示SOX2參與了多種惡性腫瘤發生發展,SOX2過表達可以促進肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞的增殖,侵襲和轉移[15-18]。由此我們可以推測益腎骨康方可能是通過下調SOX2的表達來發揮抑制肺癌A549細胞的增殖和轉移活性。

本研究我們將440個差異表達基因利用生物信息學方法制作了PPI網絡圖,剔除孤立的節點,根據Degree值篩選出了排名前37的關鍵靶點,通過查閱文獻分析找出了2個連接度較高且與腫瘤增殖轉移相關的基因:MMP9和CCL2,其中連接度最高的基因是MMP9。在益腎骨康方組中肺癌A549細胞的MMP9、CCL2基因表達下調。在腫瘤發展過程中,基底膜破壞通常是支持腫瘤入侵和轉移的重要步驟。基質金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinase，MMP)家族成員可以分為幾個組,如明膠酶,膠原酶,基質溶酶,母質溶酶和膜型基質金屬蛋白酶,MMP能夠降解和修飾細胞外基質和基底膜的大部分成分[19-20],與腫瘤擴散及患者預后相關[21]。其中,MMP9是研究最廣泛的MMPs之一。MMP9是降解細胞外基質中膠原蛋白和非膠原蛋白最重要的內肽酶,在多種腫瘤中高表達。MMP9在腫瘤的侵襲、轉移及血管形成中發揮關鍵作用[22]。CC趨化因子配體2(CC Chemokine Ligand 2,CCL2)是趨化因子家族的成員。趨化因子家族是一類小分子分泌蛋白,能夠引起白細胞向目的部位聚集,最終引起炎癥反應[23]。CCL2可招募腫瘤相關巨噬細胞浸潤腫瘤部位、促進破骨細胞成熟、免疫應答逃避和促進腫瘤新生血管生成,從而參與調控腫瘤細胞生長[24-26]。有研究表明CCL2在乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌和胰腺癌等癌癥中高表達,與不良預后有關[27-29]。由此我們可以推測益腎骨康方可能是通過下調MMP9和CCL2表達來抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移。

綜上所述,益腎骨康方能促使腫瘤細胞發生凋亡,從而抑制肺癌細胞的生長活性和轉移活性。益腎骨康方的抗腫瘤作用機制可能是通過下調SOX2、MMP9和CCL2基因的表達,最終抑制了肺癌A549細胞的增殖和轉移能力。但是其發揮藥理學作用的具體活性成分及更深層面的作用機制有待進一步研究。本研究利用轉錄組基因測序技術和生物信息學方法初步篩選出益腎骨康方作用的關鍵基因,但其在體內是否是通過該靶點發揮抗腫瘤作用還有待進一步的驗證。