乙腦/寨卡嵌合病毒株的生物學特性及免疫原性鑒定

黃榮，冷生玲，馮亞嵐，唐麗萍，袁磊，楊健

(1.川北醫學院基礎醫學與法醫學院，四川 南充 637000；2.綿陽市中心醫院感染科，四川 綿陽 621000)

寨卡病毒(zika virus，ZIKV)屬黃病毒科黃病毒屬，是單鏈RNA病毒，編碼3個結構蛋白(C，prM，E)和7個非結構蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5)[1]。ZIKV主要傳播媒介為伊蚊，性傳播也有報道[2]。成人感染癥狀輕微，但有研究[3-4]顯示，ZIKV感染與新生兒小頭畸形、成人格林巴利綜合征(GBS)存在密切聯系。ZIKV主要在熱帶和亞熱帶地區流行，2015～2016年巴西寨卡病毒病大暴發，導致全球約150萬人感染，WHO將ZIKV感染列為國際關注的突發公共衛生事件[5]。ZIKV對全球已造成較大的經濟和健康負擔，尚且無特效藥，接種疫苗成為防控最有效的方式。一些DNA疫苗、滅活病毒疫苗等作為ZIKV疫苗候選株已進入臨床試驗階段[6]。

目前ZIKV的毒力機制及其介導的免疫效應尚不清晰，嵌合減毒活疫苗較DNA疫苗、滅活疫苗來說，免疫原性更強，安全性更高，更適合作為ZIKV疫苗研發的發展方向。自90年代來，嵌合疫苗技術已用于開發了多種不同血清型的黃病毒疫苗候選株[7-8]，該方法將黃病毒的prM/E序列嵌合已許可上市的其他黃病毒減毒活疫苗的骨架中，均獲得良好的結果。本課題組在前期以乙腦疫苗株SA14-14-2為骨架嵌合ZIKV的prM/E序列，成功構建并拯救乙腦/寨卡嵌合病毒JE/ZIKA，本研究以此為基礎，進一步探索該嵌合病毒作為疫苗候選株的安全性和有效性，分析JE/ZIKA作為ZIKV嵌合疫苗的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

地鼠腎(BHK21)細胞為川北醫學院病原中心實驗室保存，嵌合病毒JE/ZIKA為本室拯救保存。清潔級昆明鼠，體重10～14 g，由川北醫學院實驗動物中心提供。病毒學實驗于川北醫學院病原中心BSL-2實驗室進行，動物實驗方案經川北醫學院動物實驗倫理委員會批準通過。

1.2 方法

1.2.1 病毒的噬斑形態鑒定 將連續10倍等比稀釋的嵌合病毒液和乙腦疫苗株SA14-14-2病毒液分別接種于鋪滿BHK21細胞的6孔板中，0.4 mL/孔，每個梯度設置復孔，于37 ℃ 5% CO2培養箱中吸附1 h，每隔20 min搖晃6孔板1次，使得病毒液與細胞均勻吸附。吸掉病毒液，將含4%FBS MEM培養基和2%低熔點瓊脂糖等體積混合后加入6孔板中覆蓋細胞，2 mL/孔，待孔中覆蓋物冷卻后將6孔板放置于37 ℃ 5% CO2培養箱中培養4～5 d，用4%甲醛溶液固定30 min，接著用10 g/L結晶紫染色10 min，流水沖洗，比較嵌合病毒和SA14-14-2的噬斑大小。

1.2.2 復制能力檢測 分別以MOI=0.1、0.01、0.001將嵌合病毒接種到鋪滿單層BHK21細胞的75 cm2的培養瓶中，以MOI=0.01將SA14-14-2同樣接種BHK21細胞作為對照組，繼續培養，每隔12 h取200 μL上清液于-80 ℃凍存，直到細胞全部病變死亡。收集1～7 d樣本，用噬斑實驗逐一檢測各個上清樣本中病毒的滴度，以感染時間為橫坐標，病毒滴度為縱坐標，繪制生長曲線。

1.2.3 神經毒力LD50和神經侵襲力檢測 用嵌合病毒JE/ZIKA(2.7×106PFU/mL)分別通過皮下和腹腔途徑(輔腦內空刺)、腦內途徑接種昆明鼠，乙腦疫苗株SA14-14-2做對照，觀察14 d，計算小鼠死亡率。10倍系列稀釋嵌合病毒至10-7，從10-2稀釋度開始，每個稀釋度腦內接種昆明鼠各6只，0.03 mL/只，接種后3 d內死亡者不計，飼養14 d，用Reed-Muench法計算神經毒力LD50。

1.2.4 免疫原性分析 嵌合病毒JE/ZIKA(2.7×106PFU/mL)分別以皮下和腹腔途徑各接種50只成鼠，皮下途徑0.1 mL/只，腹腔途徑0.5 mL/只。于免疫后第1～10周每周采血(每次各采集5只小鼠)，分離血清，測定中和抗體效價(PRNT50)，以 PRNT 50>10為陽轉，計算 GMT。

1.2.5 嵌合病毒JE/ZIKA免疫對自身的免疫保護 嵌合病毒JE/ZIKA(2.7×106PFU/mL)用不含血清的MEM進行10倍系列稀釋至10-5，分別用原倍病毒、10-1、10-3和10-5倍稀釋病毒免疫體重為10～12 g 的昆明鼠共40只，每組各10只，每只皮下注射0.1 mL，免疫14 d后，小鼠腦內注射0.03 mL(滴度為100 LD50)嵌合病毒，觀察14 d，計算5組小鼠的死亡率。

1.2.6 嵌合病毒接種對小鼠乙腦病毒腦炎的交叉保護 嵌合病毒JE/ZIKA(3.45×106PFU/mL)皮下免疫昆明鼠10只，0.1 mL/只，免疫14 d后，用乙腦野毒株SA14(滴度為100LD50)腹腔攻擊，觀察14 d，記錄小鼠死亡情況。

2 結果

2.1 嵌合病毒噬斑鑒定結果

將嵌合病毒JE/ZIKV和乙腦疫苗株病毒JEV SA14-14-2在BHK21細胞上噬斑進行比較，發現嵌合病毒JE/ZIKA噬斑直徑小于JEV SA14-14-2的噬斑直徑。見圖1。

2.2 病毒的增殖曲線

不同MOI收獲的嵌合病毒峰值均可達到6.5 lg PFU/mL左右，滴度均在接種后第108 h左右達到高峰，隨后滴度緩慢下降。MOI=0.001接種組病毒滴度上升較慢，但高峰滴度較另外兩組略高。用JE/ZIKA和JEV SA14-14-2分別接種BHK21細胞(MOI=0.01)，JEV SA14-14-2于接種后60 h內病毒增殖較快，在60 h出現復制高峰后開始緩慢下降，而JE/ZIKA在接種后增殖速度較JEV SA14-14-2快，接種96 h也未達到高峰滴度。見圖2及圖3。

2.3 神經毒力和神經侵襲力檢測結果

通過皮下及腹腔途徑接種嵌合病毒，各組昆明鼠均未出現發病或死亡情況，而腦內途徑接種組小鼠于14 d全部死亡，SA14-14-2接種組小鼠均健存。分別用10倍梯度系列稀釋JE/ZIKA腦內接種昆明鼠，測定JE/ZIKA對3周齡昆明鼠的LD50為2.4 PFU(0.03 mL)，見表1及表2。

表1 嵌合病毒對3周齡小鼠的神經毒力和神經侵襲力檢測結果

表2 嵌合病毒對3周齡小鼠的神經毒力LD50

2.4 免疫原性分析

對皮下和腹腔接種嵌合病毒小鼠分別每周采血分離血清，皮下途徑免疫的小鼠，中和抗體效價在免疫后第6周達到高峰，GMT達到109；腹腔免疫組，在免疫后兩周達高峰，GMT為107，但以后迅速下降。所有樣本PRNT50≥10，陽轉率為100%。見圖4及表3。

表3 嵌合病毒皮下、腹腔免疫后小鼠中和抗體產生情況

2.5 嵌合病毒JE/ZIKA免疫對自身的免疫保護

稀釋度為10-6和10-5PFU量的嵌合病毒可以對小鼠產生90%的腦內攻擊保護，隨著病毒量的降低，保護效力也隨之降低，說明病毒顆粒量與小鼠免疫保護效力的產生存在正相關關系。見圖5。

2.6 嵌合病毒接種對小鼠乙腦病毒腦炎的交叉保護作用

滴度為3.45×106PFU/mL的嵌合病毒JE/ZIKA免疫，可對小鼠受致死量乙腦野毒株SA14的腹腔攻擊產生40%保護率。見圖6。

3 討論

本課題組前期采用反向遺傳學技術用相應ZIKV標準株MR766序列替換了乙腦疫苗株SA14-14-2的prM/E序列，構建并拯救獲得穩定的嵌合病毒JE/ZIKA，進行初步毒力檢測發現該重組嵌合病毒對昆明鼠有較強的腦內神經毒力[9]，以此為基礎，本研究對嵌合病毒JE/ZIKA的安全性和有效性進行了進一步評價。在BHK21細胞中進行生物學特性檢測，發現相對于骨架乙腦疫苗株SA14-14-2，嵌合病毒JE/ZIKA表現出更小的噬斑，為類似母本株MR766的小噬斑[10]，說明JE/ZIKA可能具有較弱的細胞浸潤能力，其侵染細胞后形成的噬斑形態主要由結構蛋白的特征決定。對比骨架株SA14-14-2，嵌合病毒生長曲線相對更平緩，峰值出現較晚，提示其具有較慢的復制效率。Yang等[11]研究結果顯示，嵌合病毒JE/DENV2在細胞中的復制效率明顯低于兩種母本株病毒，由于不同黃病毒的蛋白結構及信號序列特點不同，導致黃病毒的種間嵌合可能表現出比母本病毒更低的復制效率。隨后本研究小組對嵌合病毒的神經侵襲力進行了評價，發現JE/ZIKA皮下注射(輔腦內空刺)或腹腔途徑接種小鼠均無發病，說明該嵌合病毒皮下和腹腔神經侵襲力弱，猜測可能與其母本病毒MR766神經侵襲力較弱有關[12]。進一步對該嵌合病毒進行免疫原性評估，發現在使用JE/ZIKA免疫昆明鼠后第1周，小鼠血清中即檢測出具有保護效力的中和抗體，抗體在單次免疫7周后保護效果依然可觀，由于課題組無ZIKV野毒株MR766及ZIKV其它野毒株，該中和抗體效力僅針對嵌合病毒本身，但依然可認為JE/ZIKA具有良好的免疫原性。該結果在昆明鼠體內實驗中得到進一步證實，中高濃度的病毒量能夠保護90%的小鼠免受病毒的致死性攻擊，而隨著免疫原病毒量降低，其對小鼠的保護效力也隨之下降，說明病毒顆粒量與小鼠抗體產生存在一定范圍內的劑量依賴性。

有研究[11,13-14]以SA14-14-2為骨架嵌合DENV不同血清型拯救的嵌合病毒在動物模型中均表現出良好的免疫原性，而且同時具有良好的抗 JEV和抗DENV感染免疫保護效果。為了檢測嵌合病毒JE/ZIKA是否具有該特性，使用JE/ZIKA免疫小鼠后，用乙腦野毒株SA14進行腹腔攻擊，結果顯示嵌合病毒JE/ZIKA可對SA14產生40%的保護效力。Li等[15]報道JEV NS1蛋白在抗病毒免疫中有重要作用，因此推測可能是由于JE/ZIKA骨架區SA14-14-2的非結構蛋白NS1誘發了免疫保護力。ZIKV與JEV同屬黃病毒屬，E蛋白是關鍵的保護性抗原[16]，不同黃病毒間E蛋白結構相似，其中ZIKV的結構與DENV存在高度同源性，DENV2序列與ZIKV一致性高達54%[17]，有學者[18]報道，ZIKV與其他黃病毒間存在較大的交叉反應，因此也不排除交叉反應的可能性。

Li等[19]使用ZIKV亞洲分離株FSS13025的prM/E替換SA14-14-2中的相應區域，成功獲得嵌合型chinZIKV，該嵌合病毒與本研究所獲嵌合病毒JE/ZIKV相比較，于埃及伊蚊體內未檢測到傳染性，在Balb/c小鼠體內神經毒力弱，同時免疫原性強，可以產生垂直保護。本實驗選用的非洲標準株MR766神經毒力強[20]，這可能是導致嵌合病毒JE/ZIKA對小鼠腦內毒力強的主要原因之一，但對小鼠基本無神經侵襲力，具有良好的免疫原性。此外，ZIKA動物模型及免疫策略的選擇會對嵌合病毒的免疫原性和保護效力評價產生一定影響。本實驗選用動物為清潔級昆明鼠，是神經系統損傷性疾病的重要造模動物，對神經細胞損傷易感，在腦內接種病毒后較Balb/c小鼠神經系統癥狀明顯且發病率高，更適合用于ZIKV引起的中樞神經系統損傷機制研究，但昆明鼠并非ZIKV感染的敏感動物模型[21]。

綜上所述，嵌合病毒JE/ZIKA具有良好的免疫原性，可作為潛在的疫苗候選株，但神經毒力較強，在后續實驗中我們還將進一步嘗試對該嵌合病毒進行位點改造以期降低其神經毒力，同時探索JE/ZIKA在ZIKV敏感動物模型中的免疫原性和安全性。