某院耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌的臨床特征及耐藥基因分析

陳淑娟 曾建英 胡麗娟

腸桿菌科細菌可引起呼吸道感染、敗血癥、泌尿系感染等，碳青霉烯類藥物因不良反應少、抗菌譜廣、抗菌活性強等優點，在治療多重耐藥腸桿菌科細菌中應用廣泛[1]。但因產超廣譜β-內酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase，ESBLs）的腸桿菌科細菌傳播，大量應用碳青霉烯類藥物，引起耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌（carbapenem resistant Enterobacteriaceae，CRE）的出現和流行，并因治療方式有限、傳播迅速的特點，導致發病率及病死率較高，增加醫院治療及防控的難度[2-3]。研究指出，耐藥酶的產生、靶點的改變等方面是CRE的耐藥機制，碳青霉烯酶為最主要耐藥機制[4]?；诖?，本研究分析CRE的臨床特點及耐藥基因，以指導臨床治療方案的擬定，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月-2021年12月莆田學院附屬醫院分離出的285株CRE。納入標準：所有標本分離所得均按照《全國臨床檢驗操作規程》執行[5]；菌株由痰液、尿液及血液等分離出。排除標準：同一患者同一部位相同的菌株。本院醫學倫理委員會已審核本研究方案，并批準實施。

1.2 方法

1.2.1 細菌鑒定及藥敏試驗 按照文獻[5]標準，藥敏試驗及細菌鑒定采用VITEK-2全自動微生物分析儀（法國生物梅里埃公司），采用英國OXOID紙片行擴散法進行復核，參照美國臨床和試驗標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2012版標準對藥敏試驗結果進行判定[6]。質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922及銅綠假單胞菌ATC27853。

1.2.2 改良碳青霉烯滅活（modified carbapenem inactivation method，mCIM） 取接種環的過夜培養純菌落（1 μl），在 2 ml胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）中，每管放美羅培南紙片（1張），（35±2）℃孵育 4 h±15 min，制備大腸埃希菌ATCC25922菌懸液（0.5麥氏濁度），對MH平板進行涂布，干燥5 min；取出TSB中美羅培南紙片，貼于 MH 平板上，（35±2）℃培養18～24 h，對抑菌圈直徑進行測量，碳青霉烯酶陽性為美羅培南抑菌圈直徑（16～18 mm 或 6～15 mm），抑菌圈內有可見散在菌落。

1.2.3 耐藥基因檢測 根據試劑盒說明書制備細菌的DNA的模板，以聚合酶鏈反應（PCR）的方式，針對12種酶（GES、KPC、NDM、SEM、NMC、VIM、GIM、OXA、SIM、IMI、SPM及IMP），合成引物，對所有引物采用比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行驗證，目的條帶采用對瓊脂糖凝膠電泳法擴增陽性產物進行確定，并進行耐藥基因測序，經過GenBank在線數據庫比對耐藥基因測序結果，并分析耐藥基因型別。

1.3 觀察指標

分析285株CRE菌株分布情況、標本來源、科室分布情況及耐藥基因，并對肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌進行耐藥性分析。

1.4 統計學處理

采用EXCEL進行全部數據相關指標計算及統計分析，計數資料以率（%）表示，對285株CRE臨床特征及耐藥基因進行分析。

2 結果

2.1 285株CRE菌株分布情況

285株CRE中主要為肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌，占比分別為83.16%、8.42%，見表1。

表1 285株CRE菌株分布情況

2.2 285株CRE標本來源

285株CRE標本主要來源于痰液、尿液、血液，占比分別為47.02%、23.86%、9.47%，見表2。

表2 285株CRE標本來源

2.3 285株CRE科室分布情況

285株CRE標本主要來源于ICU、呼吸科，占比分別為65.96%、15.79%，見表3。

表3 285株CRE科室分布情況

2.4 肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌株耐藥性分析

肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌對頭孢唑林、阿莫西林克拉維酸鉀、頭孢他啶、哌拉西林鈉他唑巴坦、頭孢曲松、頭孢吡肟、氨芐西林鈉舒巴坦鈉、亞胺培南及美羅培南等耐藥率達95.00%以上，環丙沙星及左氧氟沙星等耐藥率達90.00%以上，對替加環素較敏感，見表4。

表4 237株肺炎克雷伯菌和24株大腸埃希菌耐藥性分析

2.5 285株CRE耐藥基因分析

285株CRE中有268株檢出耐藥基因，經BLAST比對得出，209株攜帶BlaKPC-2型基因，占比為73.33%，12株攜帶BlaKPC-19型基因，占比為4.21%，26株攜帶BlaNDM-1型基因，占比為9.12%，21株攜帶BlaNDM-5型基因，占比為7.37%，CRE肺炎克雷伯菌主要攜帶BlaKPC-2型基因，CRE大腸埃希菌主要攜帶BlaNDM-5型基因，見表5。

表5 285株CRE耐藥基因分析[例（%）]

3 討論

多重耐藥或泛耐藥是CRE引起的耐藥特征，引起的感染治療較為困難，嚴重可導致死亡，且目前，CRE存在散發、爆發流行的趨勢，嚴重威脅公共衛生安全。因此，有必要對CRE的臨床特征及耐藥基因進行分析，以指導臨床治療方案的擬定。既往研究指出，CRE主要以肺炎克雷伯菌及大腸埃希菌為主[7]。本研究結果顯示，285株CRE中主要為肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌，占比分別為83.16%、8.42%。與上述研究結果相似，分析原因可能為呼吸道標本的送檢量較大，而呼吸道的主要病原菌為肺炎克雷伯菌；或可能因多數患者的疾病較為嚴重，身體抵抗力較差，為肺炎克雷伯菌的定植提供條件。

臨床特征方面，本研究結果顯示，285株CRE標本主要來源于痰液、尿液、血液，占比分別為47.02%、23.86%、9.47%。285株CRE標本主要來源于ICU、呼吸科，占比分別為65.96%、15.79%。說明CRE分布較為廣泛，主要來源于痰液、尿液，分布于ICU及呼吸科。分析原因：痰液、尿液樣本占比較多，可能與本院的樣本結構有關，而ICU患者多合并嚴重的基礎疾病，且多存在多發部位感染的傾向，使用的抗菌藥物周期長及頻率高，且多進行有創操作治療，導致ICU中CRE檢出較多[8]。而呼吸科疾病患者病情較為反復，患者普遍存在免疫力低下、住院時間長且頻率高，增加CRE定植、感染的概率，導致呼吸科中CRE檢出較多[9]。

產碳青霉烯酶是碳青霉烯類抗生素耐藥主要機制，因其編碼基因大都位于可轉移元件如質粒或轉座子上，在不同菌種菌屬間均可傳播[10]。本研究結果顯示，肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌對頭孢唑林、阿莫西林克拉維酸鉀、頭孢他啶、哌拉西林鈉他唑巴坦、頭孢曲松、頭孢吡肟、氨芐西林鈉舒巴坦鈉、亞胺培南及美羅培南等耐藥率達95.00%以上，環丙沙星及左氧氟沙星等耐藥率達90.00%以上，對替加環素較敏感。本研究中，大腸埃希菌對氨曲南和替加環素比較敏感，耐藥率分別為37.50%、0。金屬酶不能將氨曲南水解，如藥敏提示氨曲南敏感，而其他β-內酰胺類抗生素高度耐藥時，提示產金屬酶。CRE有高耐藥性特點，CRE耐藥性高可能是因為產碳青霉烯酶水解碳青霉烯類藥物，大幅降低治療效果。由于CRE治療藥物有限，應盡可能根據感染部位結合藥敏結果，以選擇最佳的抗菌治療方案。

在耐藥基因方面，王芳等[11]對成都中醫藥大學附屬醫院101株CRE進行分析，其中檢測出耐藥基因92株，占比為91.01%，測序結果提示，CRE肺炎克雷伯菌主要攜帶BlaKPC-2型基因，占比為82.43%，CRE大腸埃希菌主要攜帶BlaNDM-5型基因，占比為86.67%。本研究結果顯示，285株CRE中有268株檢出耐藥基因，經BLAST比對得出，209株攜帶BlaKPC-2型基因，占比為73.33%，12株攜帶BlaKPC-19型基因，占比為4.21%，26株攜帶BlaNDM-1型基因，占比為9.12%，21株攜帶BlaNDM-5型基因，占比為7.37%，CRE肺炎克雷伯菌主要攜帶BlaKPC-2型基因，占比為83.97%，CRE大腸埃希菌主要攜帶BlaNDM-5型基因，占比為87.50%。較上述研究結果相似，以攜帶BlaNDM-5型基因的大腸埃希菌及BlaKPC-2型基因的肺炎克雷伯菌為主。碳青霉烯酶主要為A類KPC及B類NDM，均可由質粒介導產KPC、NDM型耐藥基因，通過菌株自身克隆，或以不同菌種間水平轉移方式，引起耐藥菌株傳播[12]。

綜上所述，CRE有高耐藥性特點，且在臨床分布較為廣泛，來源較廣，同時CRE以攜帶BlaNDM-5型基因的大腸埃希菌及BlaKPC-2型基因的肺炎克雷伯菌為主，應對CRE感染，個體應開展耐藥基因及耐藥性的檢測，以幫助臨床醫師選擇治療方案，減少細菌耐藥，增強臨床治療效果。