海南高山榕果實中總黃酮提取工藝的優(yōu)化

秦延君 潘葉 馮繼杏 周安強 王文嬌 白麗麗

（海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 海南海口 571199）

高山榕(Ficus altissimaBlume)，又名闊葉榕、大青樹榕等，桑科榕屬，常綠多年生喬本植物，適用于作行道樹、園景樹和庭蔭樹，在中國海南、廣西、廣東、云南等地均有栽種[1]。作為廣東、海南及云南西雙版納地區(qū)的民間用藥，高山榕葉具有清熱、解表和化濕的功效，可用于治療流行性感冒、瘧疾、支氣管炎及急性腸炎等[2-3]。黃酮（flavonoids) 是化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的一類化合物，具有抗腫瘤[4-5]、抗病毒、抗心血管[6]和降血壓、抗抑郁[7]、抗氧化[8]等多種藥理作用。據(jù)文獻報道，高山榕氣生根、葉及果實中主要含有黃酮類、香豆素類、三萜類及揮發(fā)油等成分，已經(jīng)從高山榕果實中分離鑒定出39 個黃酮類化合物[9]。為探索高山榕果實中總黃酮的提取方法，本研究通過正交試驗法提取總黃酮并優(yōu)化其工藝，為高山榕植物資源的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器UV1600 型紫外可見分光光度計(北京瑞利分析儀器有限公司)；B210S 分析天平(北京賽多利斯有限公司)；KQ-200KDE 超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；XP205 電子分析天平(瑞士梅特勒托利多)

1.1.2 試劑亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇等均是分析純（天津大茂化學(xué)試劑廠），水為新制蒸餾水。蘆丁（中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-202012）。

1.1.3 試材高山榕果實采摘自海南海口市美林路街邊綠化樹，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院楊衛(wèi)麗教授鑒定為桑科榕屬高山榕（Ficus altissimaBlume）果實，陰干后，粉成細粉，備用。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液制備取蘆丁對照品在70℃條件下干燥至恒重，并精密稱定10.25 mg，置于50 mL 容量瓶，用60%乙醇溶液定容至刻度線后超聲5 min，得0.205 mg/mL 對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備精確稱取干燥粉碎的高山榕果實粉末1.0 g，置于圓底燒瓶中，按照實驗設(shè)計方案提取一定時間，將提取液進行抽濾，用60%乙醇將濾液定容至50 mL，搖勻，備用。

1.2.3 檢測波長的選擇分別精密量取對照品溶液、供試品溶液以及空白溶液各 4.0 mL，置于25 mL 的容量瓶中；再精密量取1 mL 的5% 亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6 min；加入1 mL 的10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min；加入8 mL 的4%氫氧化鈉溶液，然后用60%乙醇溶液定容，搖勻，放置15 min；于200～600 nm 波長處進行掃描，蘆丁對照品溶液與供試品溶液的最大吸收波長均在506 nm 處，故選用506 nm 作為檢測波長。

1.2.4 線性范圍考察分別精密量取蘆丁對照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 置于25 mL容量瓶中，按1.2.3 方法進行操作，在波長506 nm處測定其吸光度；以蘆丁對照品溶液濃度作為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（Y），進行線性回歸。得到回歸方程如下：Y=15.604X-0.015 4，（R2=0.999 7）。由試驗結(jié)果可知，蘆丁在 0～48 mg/L 內(nèi)線性關(guān)系良好，標準曲線見圖1。

1.2.5 穩(wěn)定性考察精密量取4 mL 的供試品溶液于50 mL 容量瓶中，操作同1.2.3，放置于室溫及密閉環(huán)境下，分別在0、15、30、60、90、120 min 測定其吸光度，RSD為3.6%（n=6）。結(jié)果表明，供試品溶液在120 min 之內(nèi)較穩(wěn)定，滿足試驗要求。

1.2.6 精密度試驗精密量取4 mL 對照品溶液于50 mL 容量瓶中，操作同1.2.3，于506 nm 進行測定其吸光度，連續(xù)測定5 次，其RSD為2.8%（n=5），結(jié)果顯示，儀器精密度良好。

1.2.7 重復(fù)性試驗精密量取供試品溶液6 份，操作同1.2.3，分別測定各個溶液的吸光度值，其RSD為1.04%（n=6）。根據(jù)結(jié)果可知，該分析方法重復(fù)性良好。

1.2.8 加標回收試驗精密量取1 mL 供試品溶液6 份，分別置于25 mL 容量瓶中，加入蘆丁對照品溶液1 mL，操作同1.2.3 項，依次測定其吸光度，以空白液作參比。由表1 可知，回收率在98.20%～100.50%，平均回收率為99.31%，RSD=0.84%（n=6）。結(jié)果表明，本試驗方法回收率良好，滿足試驗的要求。

表1 加標回收試驗數(shù)據(jù)

1.2.9 總黃酮的提取工藝優(yōu)化以料液比1∶25（g∶mL）、乙醇60%、提取2 h 和提取3 次作為基礎(chǔ)操作，分別以不同的乙醇體積分數(shù)、料液比及提取時間為單因素進行試驗操作，試驗設(shè)計見表2。由于吸光度與總黃酮提取率成正比，故以吸光度表示各因素對總黃酮提取效果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比對提取效果的影響由圖2 可知，隨著料液比的增大，高山榕總黃酮得率先增大后減小。隨著料液比的逐步增加，高山榕總黃酮與提取劑之間接觸越來越充分，總黃酮溶出度增加。當(dāng)料液比為1∶25（g/mL）時，總黃酮提取率達到最大值；繼續(xù)增大料液比，反而促進雜質(zhì)的溶出，抑制總黃酮的溶出，導(dǎo)致高山榕總黃酮提取率降低。

2.1.2 乙醇體積分數(shù)對提取效果的影響由圖3可知，總黃酮提取率隨乙醇體積分數(shù)的增大先增大后減小，在50%時到達最大值，繼續(xù)升高乙醇濃度，總黃酮提取率反而下降，這可能是由于黃酮類物質(zhì)的極性與乙醇溶液極性相近，有利于總黃酮的溶出；而當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增大，脂溶性增強，一些脂溶性物質(zhì)的溶出逐漸增多，抑制了黃酮類物質(zhì)的溶出，降低了總黃酮得率。

2.1.3 提取時間對提取效果的影響由圖4 可知，隨著提取時間的延長，高山榕總黃酮提取率先增大后減小。當(dāng)提取2.5 h 時，總黃酮的得率達到最大值；繼續(xù)增加提取時間，導(dǎo)致溶出的總黃酮物質(zhì)發(fā)生氧化、降解等，從而使總黃酮得率降低。

2.2 正交試驗結(jié)果

稱取9 份高山榕粉末，每份1.0 g，加入相應(yīng)濃度的乙醇溶液，加熱回流、過濾，用60%乙醇溶液定容至50 mL 容量瓶中；采用分光光度法測其吸光度，依據(jù)回歸方程計算含量，正交試驗結(jié)果見表3，方差分析見表4。由表3、4 可知，各因素的影響作用依次表現(xiàn)為B>C>A>D，即乙醇體積分數(shù)>提取時間>料液比>提取次數(shù)。由于提取3 次會造成溶劑的浪費、降低提取效率，并且還有可能引入雜質(zhì)，故綜合表3、4，確定高山榕果實中總黃酮的最優(yōu)提取工藝為A3B1C3D2，即乙醇體積分數(shù)為50%，提取時間2.5 h，料液比為1∶25，提取2 次。

表3 正交試驗結(jié)果

表4 方差分析

2.3 最優(yōu)工藝驗證

為考察上述工藝，以A3B1C3D2為提取條件進行3 組重復(fù)提取試驗，得出高山榕果實中總黃酮提取率均值達到（1.031±0.004）%。

3 結(jié)論

通過上述單因素及正交試驗結(jié)果可知，4 個因素對高山榕總黃酮得率的影響程度依次為：乙醇體積分數(shù)＞提取時間>料液比＞提取次數(shù)，其中乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取率影響較大，在提取時如果采用較高濃度乙醇，將促使大量的雜質(zhì)溶出，抑制總黃酮的溶出，同時還造成溶劑的浪費，故采用50%的乙醇作為最優(yōu)提取溶劑。方法學(xué)的各項驗證均滿足實驗要求，本試驗優(yōu)化后的提取工藝和方法，適用于高山榕果實中總黃酮的提取。高山榕在我國資源分布廣泛，果實采摘后對樹木的生長幾乎無影響。本研究為高山榕果實中黃酮類活性成分的利用提供了有力支撐，對利用高山榕果實豐富我國藥用資源具有一定的意義。