HEK293T細胞中NLRP3炎性小體活化體系的構建

羅 玲，趙 鍇

（中南大學湘雅三醫院血液科，長沙 410013）

NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎性小體是一類存在于巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞等免疫細胞胞漿中的多聚蛋白復合體，由NLRP3、凋亡相關點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC ）和胱冬肽酶-1（Cas-pase-1）三種蛋白組成［1-3］。NLRP3炎性小體作為天然免疫系統重要的組成部分［4-5］，在多種生理、病理過程中發揮著關鍵作用，可被入侵機體的病原微生物，如病毒、細菌、真菌等活化，同時也對損傷細胞釋放出來的自身物質（如脂肪酸、ATP）和環境中的顆粒（如二氧化硅顆粒）等產生應答。該復合體活化后可通過Caspase-1誘導促炎細胞因子白細胞介素1β前體（pro-IL-1β）和白介素18前體（pro-IL-18）的成熟和分泌，同時激活打孔蛋白消皮素D（gasdermin D，GSDMD），促使GSDMD釋放出活性N端蛋白，隨后聚集在細胞膜上造成細胞膜孔形成，從而引起細胞焦亡［6-7］。研究表明，NLRP3炎性小體的異常活化與關節炎、膿毒癥、痛風、硅肺、阿尓茨海默病、2型糖尿病、肥胖等急慢性炎癥疾病以及自身免疫性疾病密切相關［8-10］，因此，NLRP3炎性小體的活化調節機制以及靶向藥物開發一直是本領域關注的前沿熱點。

目前已有不少研究者提供了NLRP3炎性小體活化的研究方法，其中在HEK293T細胞中重建NLRP3炎性小體活化體系是一種簡便可行的方法［11-12］。由于HEK293T細胞中不表達NLRP3炎性小體組分，故轉染過表達該組分可以促使NLRP3炎性小體組裝并活化［11-12］。該重建方法為研究NLRP3炎性小體活化的調控機制（如蛋白間相互作用、翻譯后修飾［13-15］等）以及相關藥物的篩選提供了一個簡化的研究平臺。本研究旨在建立一種HEK293T細胞NLRP3炎性小體活化體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株與質粒

HEK293T細胞凍存于本實驗室，原購自美國模式培養物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）。

質粒pcDNA3.1（-）B-Flag-pro-IL-1β、pcDNA3.1（-）B-Flag-pro-Caspase-1、pcDNA3.1（-）B-Flag-ASC、pcDNA3.1（-）B-Myc-NLRP3為本實驗室常規構建［16］。

1.1.2 試劑耗材與儀器

試劑耗材有胎牛血清（Gibco）、培養基Dulbecco改良 Eagle培養基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）（Gibco）、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（Trypsin-EDTA solution，0.25%）（Thermo fisher）、Nigericin（invivogen）、轉染試劑Linear Polyethylenimine 25000（Polysciences）、改良的 Minimal Essential Medium減血清培養基（Opti-MEM）（Gibco）、Anti-IL-1β抗體（RD systems）、Anti-β-actin抗體（Cell Signaling Technology）、Anti-Flag-tag（Cell Signaling Technology）、Anti-Myc-tag（Cell Signaling Technol ogy）、細胞裂解液（Cell Lysis Buffer，CLB）（Cell signaling Technology）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（Thermo fisher）和酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）試劑盒（eBioscience）。儀器有37℃恒溫培養箱（Thermo fisher）、離心機（eppendorf）、洗脫搖床（江蘇榮華儀器制造有限公司）、酶標儀（Thermo Scientific）和ChemiDoc高靈敏度化學發光成像儀（Bio-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 HEK293T細胞培養

用DMEM完全培養基（DMEM培養液中添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素）培養HEK293T細胞。于37℃、5% CO2恒溫培養箱中進行孵育，待細胞密度長至80%～90%后，經0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，在37℃下消化3 min后，加入1 mL 293T細胞培養基停止消化過程，再以800 r/min離心細胞懸液5 min。重懸細胞并計數后，將293T細胞接種于細胞培養皿（24 孔板：4×105個/孔）中過夜，待細胞密度達到70%～80%時準備轉染工作。

1.2.2 質粒轉染

在 1.5 mL Eppendorf中混勻質粒 pro-IL-1β（每孔200 ng）、pro-Caspase-1（每孔100 ng）、ASC（每孔20 ng）、NLRP3（每孔100 ng）與Opti-MEM培基（每孔 50 μL）。在另一個 1.5 mL Eppendorf管中混勻Opti-MEM培養基（每孔50 μL）與Linear Polyethylenimine 25000轉染試劑。轉染試劑按照3 μL轉染試劑對應1 μg質粒的比例加入。再將稀釋的質粒和稀釋的轉染試劑混合在一起，室溫下靜置15～20 min。將質粒與轉染試劑混合物逐滴滴入細胞中，并輕輕搖動細胞板，以避免局部出現高濃度轉染物，影響細胞活力。轉染24 h后，收集細胞蛋白用于Western blot檢測，或者用250 μL DMEM完全培養基替換原培養基繼續培養，6 h后，加入10 μmol/L Nigericin，刺激1 h，收集細胞上清，2 000 r/min離心5 min去除細胞殘渣和碎屑，取50 μL利用ELISA檢測IL-1β的量。

1.2.3 Western blot檢測

將轉染處理后的細胞加入預冷的裂解液（CLB細胞裂解液、100 ×蛋白酶抑制劑PMSF和100 ×蛋白酶抑制劑cocktail）中收取蛋白樣本，BCA法測定蛋白濃度，將各蛋白樣品調整至等質量，加入5 ×上樣緩沖液后，100℃煮10 min使蛋白變性。12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）上樣，電泳分離蛋白質，再在260 mA穩流中將蛋白轉至聚偏二氟乙烯［poly（vinylidene fluoride），PVDF］膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉膜1 h后，一抗于4℃孵育過夜。TBST（50 mmol/L Tris-Hcl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl和0.1% Tween-20配制而成）液洗膜3遍，每次10 min，再用對應二抗分別室溫孵育1 h，TBST液洗膜3遍，每遍10 min。最后用ChemiDoc高靈敏度化學發光成像儀顯出蛋白條帶。

1.2.4 ELISA

按照制造商的說明進行ELISA，檢測細胞上清液中IL-1β的含量。

1.2.5 統計分析

本試驗結果利用GraphPad Prism 9.0進行統計分析，試驗得到的數據通過單因素方差分析（One-Way ANOVA）計算得到P值，統計學顯著差異用*表示，其含義分別是*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.000 1。當*P＜0.05時，為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 HEK293T中驗證質粒的表達

首先驗證構建質粒的表達。將pro-IL-1β、pro-Caspase-1、ASC、NLRP3質粒以及空載體質粒轉染至HEK293T細胞中，24 h后，收取細胞總蛋白，通過Western blot檢測表達。結果顯示，所有質粒均表達（圖1）。

圖1 Western blot驗證HEK293T細胞中質粒的表達Fig. 1 The expression of plasmid in HEK293T cells was verified by Western blot

2.2 HEK293T中NLRP3炎性小體活性的檢測

NLRP3炎性小體活化的標志之一是產生成熟的IL-1β。IL-1β的前體（pro-IL-1β，相對分子質量約為37 kD）可被Caspase-1切割形成成熟體（相對分質子量為17 kD），成熟體通過細胞孔道釋放到細胞外，發揮生物活性［17］。因此，我們可利用Western blot 以及ELISA分別檢測細胞蛋白和上清中的IL-1β成熟體。

通過Western blot發現，只轉染pro-IL-1β或者只轉染部分NLRP3炎性小體組分（轉染ASC，或NLRP3和ASC共轉染）的細胞總蛋白中檢測不到IL-1β成熟體，只有轉染了NLRP3炎性小體全部組分的細胞總蛋白可檢測到IL-1β成熟體（圖2）。同時，利用ELISA檢測細胞上清中的IL-1β，得到的結果和Western blot檢測一樣（圖3）。以上結果說明，在HEK293T中構建NLRP3炎性小體活化體系成功。

圖2 Western blot檢測重建NLRP3炎性小體組分的HEK293T細胞總蛋白中的IL-1β成熟體Fig. 2 Detection of mature IL-1β in cell lysates from HEK293T cells reconstituted with NLRP3 inflammasome components by Western blot

圖3 ELISA檢測重建NLRP3炎性小體組分的HEK293T細胞上清中的IL-1βFig. 3 Detection of IL-1β in supernatants of HEK293T cells reconstituted with NLRP3 in flammasome components

2.3 NLRP3轉染量與NLRP3炎性小體活性正相關

為了進一步研究HEK293T中NLRP3炎性小體活化體系，我們固定ASC、Caspase-1以及pro-IL-1β的轉染量，同時轉染不同量的NLRP3（50、100、200 ng），發現隨著NLRP3轉染量的提高，無論是細胞中或者上清中IL-1β的成熟體都是逐漸增加的（圖4、5），并呈一個正相關的趨勢。以上結果說明，改變NLRP3質粒的轉染量可調整HEK293T中炎性小體活化的強度。

圖4 Western blot檢測不同NLRP3轉染量對HEK293T中重建炎性小體的影響Fig. 4 The effects of transfected NLRP3 amounts in reconstruction of inflammasome in HEK293T cells by Western blot

3 討論

HEK293T細胞來源于人胚胎腎上皮細胞，是一個研究外源基因表達的常用細胞系［18-20］。HEK293T細胞中不表達NLRP3炎性小體組分，自2006年首次報道在該細胞系中構建炎性小體活化體系后［21］，其逐漸成為用于體外研究NLRP3炎性小體活化的常規工具細胞系［11-12］。本研究首先驗證了質粒NLRP3、ASC、Caspase-1以及pro-1β的表達，接著將不同量的質粒共轉染至HEK293T中構建NLRP3炎性小體活化體系，發現轉染缺少完整炎性小體組分的HEK293T細胞中幾乎檢測不到IL-1β成熟體，而轉染了NLRP3炎性小體所有組分后，則可檢測到IL-1β成熟體，說明NLRP3、ASC和Caspases-1是體外構建NLRP3炎性小體活化體系必不可少的元件，這也與之前的文獻報道相一致［11-12］。同時，我們在此基礎上對該體系進行了進一步的探索，發現在不改變ASC、Caspase-1以及pro-IL-1β的轉染量的情況下，增加NLRP3轉染量可促進更多IL-1β成熟體的產生。該結果提示，改變NLRP3轉染量可調控HEK293T細胞中炎性小體活化的強度，這也為不同實驗室在各自研究體系下優化該系統提供了一定的參考。另外，我們還介紹了通過Western blot以及ELISA兩種方法檢測HEK293T中NLRP3炎性小體活化的情況，通過比對兩種方法的檢測效果可以發現，兩者提供的檢測效能較一致，因此，其他實驗室也可選擇任何一種方式來檢測炎性小體的活化。在這里，我們更推薦使用ELISA方法檢測，因為Western blot的操作流程復雜，完成一次操作的試驗時間較ELISA檢測更長，且ELISA的檢測結果是以數字形式呈現的，用于結果定量更加方便。綜上所述，我們提供了在HEK293T細胞中建立NLRP3炎性小體活化體系的方法，該方法的建立為后期進一步研究NLRP3炎性小體的調控機制奠定了基礎。

圖5 ELISA檢測不同NLRP3轉染量對HEK293T中重建炎性小體的影響Fig. 5 The effects of transfected NLRP3 amounts in reconstruction of inflammasome in HEK293T cells by ELISA