肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因轉(zhuǎn)染對(duì)骨質(zhì)疏松骨愈合的影響及其作用機(jī)制

史凡祺，甄瑞鑫，鄭鑫，劉世全，王媛媛

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，1.微創(chuàng)脊柱外科；2.胃腸外科；3.胸外科；4.承德中心醫(yī)院眼科，河北 承德 067000)

骨質(zhì)疏松為絕經(jīng)后女性群體常見代謝性疾病之一，主要表現(xiàn)為骨組織微結(jié)構(gòu)損傷、易骨折、骨量下降以及骨脆性上升等[1]。骨折后所致長(zhǎng)時(shí)間臥床較易造成一系列并發(fā)癥發(fā)生，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，嚴(yán)重者甚至威脅生活安全[1-2]。目前研究[3-4]顯示，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子等細(xì)胞外信號(hào)分子可明顯加快骨骼再生以及骨愈合進(jìn)程。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)是一種刺激肝細(xì)胞增殖物質(zhì)，作為細(xì)胞外信號(hào)分子主要由間充質(zhì)細(xì)胞分泌，可介導(dǎo)上皮-間充質(zhì)相互作用[5]。HGF促有絲分裂作用可經(jīng)由旁分泌與自分泌過程加速肌肉吸收與利用，發(fā)揮組織修復(fù)作用[6-7]。HGF可通過調(diào)節(jié)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2介導(dǎo)的核因子-κB信號(hào)通路促進(jìn)骨再生而治療骨折[8-9]。為明確HGF在骨愈合過程中作用及影響機(jī)制，本研究擬選擇骨質(zhì)疏松性骨折大鼠模型進(jìn)行HGF基因轉(zhuǎn)染。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及材料

健康雌性C57BL/6J大鼠(廣東至遠(yuǎn)生物醫(yī)藥科技有限公司；SYXK(粵)2021-0251)，周齡為8周，體質(zhì)量(19.26±2.76)g，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22～24 ℃與相對(duì)濕度52%～58%。DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco，青霉素-鏈霉素、胰蛋白酶購(gòu)自Hyclone，F(xiàn)uGENE HD Transfection Reagent購(gòu)自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司，DNA質(zhì)粒購(gòu)自和元生物技術(shù)(上海)股份有限公司，熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)引物及試劑購(gòu)自Takare公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自上海富澤商貿(mào)有限公司，雙能X線骨密度測(cè)量?jī)x購(gòu)自阿斯邁德生物科技(北京)有限公司，微型計(jì)算機(jī)斷層掃描(μCT)儀購(gòu)自瑞士Scanco Medical AG公司，萬(wàn)能力學(xué)測(cè)試機(jī)購(gòu)自日本島津公司，PCR儀購(gòu)自瑞士Roche公司，離心機(jī)購(gòu)自力康生物醫(yī)療科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分離與培養(yǎng) 選擇1只雌性健康SD大鼠以頸椎脫臼法將其處死，在無菌環(huán)境下收集大鼠脛骨與股骨，無菌磷酸鹽緩沖溶液沖洗以保證骨表面軟組織被完全清除，脛骨與股骨兩端采用咬骨鉗咬除，骨髓腔采用DMEM/F12培養(yǎng)基多次沖洗至髓腔發(fā)白，細(xì)胞懸液經(jīng)多次吹打后以200目篩網(wǎng)過濾，過濾后收集細(xì)胞懸液，懸液經(jīng)離心處理后再次重懸，以1.0×104個(gè)/mL接種至培養(yǎng)瓶，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h進(jìn)行半換液，72 h予以全換液，其后換液頻率為2 d。每天均需要在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，至生長(zhǎng)到瓶底面積的80%時(shí)需要以1∶3比例進(jìn)行傳代。

1.3.2 HGF慢病毒載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，BMSCs細(xì)胞需要以0.5×105個(gè)/mL轉(zhuǎn)移至24孔板，應(yīng)用無抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d，保證轉(zhuǎn)染前細(xì)胞融合率達(dá)至80%～90%。50 mL無血清DMEM/F12培養(yǎng)基中加入DNA質(zhì)粒后勻混，再取50 mL無血清DMEM/F12培養(yǎng)基加入適量FuGENE HD Transfection Reagent混勻后在室溫環(huán)境下孵育5 min，孵育結(jié)束后將兩種無血清DMEM/F12培養(yǎng)基輕輕混合均勻，在室溫環(huán)境下孵育25 min，24孔板中每孔添加上述混合物100 μL與適當(dāng)體積培養(yǎng)基。細(xì)胞在加入混合物4～6 h后換液，再次培養(yǎng)18～48 h后應(yīng)用顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況，并在72 h后收集最高轉(zhuǎn)染效率細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×106個(gè)/μL進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3.3 骨質(zhì)疏松骨折模型大鼠構(gòu)建及分組 選擇100只健康雌性SD大鼠，隨機(jī)取其中80只構(gòu)建骨質(zhì)疏松模型大鼠，大鼠稱重后采用以10 mg/kg劑量1%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉處理，大鼠固定在操作臺(tái)上，消毒鋪巾后將皮膚、肌肉逐層切開，打開腹腔，沿著子宮方向向上尋找卵巢，結(jié)扎后將其切除，無菌生理鹽水沖洗處理后將腹腔關(guān)閉，術(shù)后3 d內(nèi)均采用青霉素鈉處理以預(yù)防感染。另20只作為假手術(shù)組(Sham組)需切除等量脂肪，不切除卵巢。造模后大鼠單籠飼養(yǎng)于同一房間，環(huán)境、攝食以及飲水情況均相同，3個(gè)月后測(cè)定大鼠骨密度以判斷大鼠是否建模成功。骨質(zhì)疏松大鼠最終建模成功76只，隨機(jī)分為四組，分別為模型組(Model組)、BMSCs組、空載慢病毒組(Vehicle組)與HGF慢病毒組(Vehicle+HGF組)，每組均為19只。上述四組大鼠均以1%戊巴比妥鈉麻醉后使左側(cè)脛骨顯露，于其上端1/2位置將脛骨剪斷形成骨折，骨折后以克氏針?biāo)鑳?nèi)固定。大鼠BMSCs組、Vehicle組與Vehicle+HGF組，分別以1.0×106個(gè)/kg注入BMSCs、空載慢病毒-BMSCs、HGF慢病毒-BMSCs，而Sham組與Model組則注入等量生理鹽水，各組在相同飼養(yǎng)條件下再次飼養(yǎng)1個(gè)月。

1.3.4 大鼠骨折愈合程度與骨密度測(cè)定 大鼠飼養(yǎng)結(jié)束后隨機(jī)取5只應(yīng)用X線側(cè)位片及雙能骨密度測(cè)定儀分別評(píng)估左側(cè)脛骨骨折愈合情況與骨密度，骨折愈合程度按照X線結(jié)果進(jìn)行評(píng)分[10]，評(píng)分由3位影像科醫(yī)師負(fù)責(zé)，最終骨折愈合評(píng)分結(jié)果為3位醫(yī)師評(píng)估結(jié)果均值。

1.3.5 大鼠骨痂骨參數(shù)測(cè)定 取5只大鼠再全麻條件下穿刺心臟處理，收集左側(cè)脛骨骨折標(biāo)本。將收集大鼠脛骨骨折標(biāo)本切成含有全部骨痂的塊狀物，其大小為10 mm，置于70%酒精中保存，采用micro-CT系統(tǒng)測(cè)定定量評(píng)估標(biāo)本骨參數(shù)，主要包括骨痂感興趣區(qū)平均斷面面積、相對(duì)骨體積及百分比骨體積。

1.3.6 骨痂組織中骨愈合相關(guān)因子水平測(cè)定 取4只大鼠在全麻條件下穿刺心臟處理，收集左側(cè)脛骨骨折標(biāo)本，取骨折愈合位置組織，應(yīng)用RNA提取試劑盒與反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，采用熒光實(shí)時(shí)qPCR測(cè)定骨痂組織中骨愈合相關(guān)因子骨堿性磷酸酶(BALP)、骨鈣素(OCN)、轉(zhuǎn)錄因子抗體(OSX)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)、基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)等指標(biāo)mRNA水平，依據(jù)Maxima SYBR Green qPCR Mastermix試劑盒說明書選擇各反應(yīng)物用量，反應(yīng)條件設(shè)置為：95 ℃、95 ℃、60 ℃、72 ℃環(huán)境下分別預(yù)變性處理5 min、變性處理15 s、退火處理20 s、延伸處理30 s，共需要循環(huán)45次。引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 五組大鼠骨折愈合程度評(píng)分與骨密度比較

Model組骨折愈合程度評(píng)分與骨密度低于Sham組(P<0.05)；BMSCs組、Vehicle組與Vehicle+HGF組骨折愈合程度評(píng)分與骨密度均高于Model組(P<0.05)；BMSCs組、Vehicle組骨折愈合程度評(píng)分及骨密度比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Vehicle+HGF組骨折愈合程度評(píng)分與骨密度高于BMSCs組、Vehicle組(P<0.05)。見表2。

表2 五組大鼠骨折愈合程度評(píng)分與骨密度比較

2.2 五組大鼠骨痂骨參數(shù)比較

Model組平均斷面面積、相對(duì)骨體積高于Sham組，百分比骨體積低于Sham組(P<0.05)；BMSCs組、Vehicle組與Vehicle+HGF組平均斷面面積、相對(duì)骨體積低于Model組，百分比骨體積高于Model組(P<0.05)；BMSCs組、Vehicle組平均斷面面積、相對(duì)骨體積及百分比骨體積比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Vehicle+HGF組平均斷面面積、相對(duì)骨體積低于BMSCs組、Vehicle組，百分比骨體積高于BMSCs組、Vehicle組(P<0.05)。見表3。

表3 五組大鼠骨痂骨參數(shù)比較

2.3 五組骨痂組織中骨愈合相關(guān)因子水平比較

Model組BALP、OCN、OSX、Runx2、MMP-13 mRNA低于Sham組(P<0.05)；BMSCs組、Vehicle組、Vehicle+HGF組BALP、OCN、OSX、Runx2、MMP-13 mRNA高于Model組(P<0.05)；BMSCs組、Vehicle組BALP、OCN、OSX、Runx2、MMP-13 mRNA比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Vehicle+HGF組BALP、OCN、OSX、Runx2、MMP-13 mRNA高于BMSCs組、Vehicle組(P<0.05)。見表4。

表4 五組骨痂組織中骨愈合相關(guān)因子水平比較

3 討論

大鼠骨質(zhì)疏松性骨折采用骨保護(hù)素基因修飾BMSCs處理后可顯著抑制破骨細(xì)胞活性，保證大鼠骨代謝平衡，進(jìn)而改善大鼠骨密度，顯示基因治療改善骨質(zhì)疏松性大鼠骨代謝情況的療效明確[11]。HGF為骨髓微環(huán)境細(xì)胞分泌重要生長(zhǎng)因子，不僅可以在體內(nèi)與體外介導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖分化過程，還能夠調(diào)節(jié)骨吸收以及新生過程[12]。BMSCs作為多向分化細(xì)胞，可在骨組織修復(fù)及再生方面發(fā)揮重要作用。既往研究[13-14]已證實(shí)，BMSC向成骨分化過程是骨質(zhì)疏松性骨折愈合重要機(jī)制，因此本研究選擇BMSCs作為HGF基因表達(dá)載體，以促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折骨愈合。

骨愈合過程是一個(gè)應(yīng)對(duì)骨損傷發(fā)生多階段復(fù)雜修復(fù)過程，使損傷骨生物力學(xué)以及骨功能狀態(tài)恢復(fù)正常是其最終目標(biāo)[4]。骨質(zhì)疏松性骨折愈合需要經(jīng)歷炎癥期、軟骨內(nèi)骨化期以及骨痂重塑期三個(gè)階段，軟骨內(nèi)成骨階段是骨愈合重要階段，可多向分化MSCs并促使其被大量聚集在骨折斷端，然后在生長(zhǎng)因子作用下分化成軟骨細(xì)胞，分泌出大量軟骨蛋白聚糖以及X型膠原以促進(jìn)骨折位置形成軟骨骨痂，隨后成骨細(xì)胞侵入并進(jìn)行分化，在骨基質(zhì)分泌后使小梁骨礦化，最終形成骨性骨痂以使其斷端連接[15-16]。軟骨內(nèi)骨化過程由BALP、OCN、OSX、Runx2、MMP-13等多種因子調(diào)節(jié)，其中，MMP-13是軟骨細(xì)胞降解標(biāo)志物，BALP、OCN、OSX、Runx2可反映成骨分化及礦化能力[17-18]。本研究中，相對(duì)于Sham組，Model組BALP、OCN、OSX、Runx2、MMP-13 mRNA等指標(biāo)均明顯下降，而HGF慢病毒轉(zhuǎn)染則有效改善骨質(zhì)疏松性骨折大鼠上述指標(biāo)下降狀態(tài)，顯示HGF慢病毒轉(zhuǎn)染可促進(jìn)新骨形成，加速骨折組織軟骨內(nèi)骨化過程，這對(duì)于加快骨折愈合具有積極意義。國(guó)外研究者[19]也發(fā)現(xiàn)，在小鼠骨折模型中，HGF處理可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活力，發(fā)揮較顯著的平衡成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的比例作用，上調(diào)小鼠成骨細(xì)胞中p65、IκB激酶β和IκBα的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、BMP-2受體、NF-κB配體受體激活劑和巨噬細(xì)胞集落刺激因子表達(dá)，表明HGF參與骨再生、血管生成以及成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間平衡。本研究對(duì)骨痂骨參數(shù)分析顯示，HGF慢病毒轉(zhuǎn)染可以有效改善骨痂骨參數(shù)，證實(shí)HGF慢病毒轉(zhuǎn)染可以促進(jìn)骨重塑和損傷骨組織形成致密新骨橋以連接骨折位置，改善骨痂力學(xué)性能，改善骨折愈合程度。另一項(xiàng)研究[20]顯示HGF修飾牙髓來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可高度表達(dá)成骨相關(guān)基因，具有較強(qiáng)的成骨分化能力，還可顯著減少卵巢摘除術(shù)構(gòu)建骨質(zhì)疏松模型大鼠股骨遠(yuǎn)端干骺端小梁骨骨丟失，表明采用HGF修飾牙髓來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以有效減輕骨質(zhì)疏松大鼠骨損傷，這與本研究中HGF基因轉(zhuǎn)染可以促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨愈合、改善大鼠骨密度結(jié)論類似。

綜上，HGF基因轉(zhuǎn)染可上調(diào)BALP、OCN、OSX、Runx2、MMP-13等骨愈合相關(guān)指標(biāo)水平，促進(jìn)骨重塑以及軟骨內(nèi)成骨形成，改善骨生物力學(xué)性能，進(jìn)而促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨愈合，可為骨質(zhì)疏松性骨折治療提供新思路。