基于高通量測序的5種蜘蛛所攜帶的細菌多樣性比較

高 瑛,韓 瑜,王玥琪,ALI Abid,2,崔淑艷,鄭 國

(1.沈陽師范大學生命科學學院,中國遼寧 沈陽 110034;2.費薩拉巴德農業大學昆蟲學系，巴基斯坦費薩拉巴德 38040)

細菌廣泛分布于自然界,并普遍存在于動物的各器官、組織和細胞。細菌種類豐富、群落構成復雜,參與宿主的營養代謝、生殖健康及對生境的適應等諸多生命活動[1～4],對真核生物的多樣性和演化有十分重要的影響[5～6]。隨著高通量測序技術的發展,人們對動物體微生物的多樣性、群落組成及其功能的認識逐步深入。目前,針對昆蟲微生物及其功能的相關研究工作較多[6～9]。關于蜘蛛微生物的研究,早期工作多集中于內共生菌的感染[10～13]以及內共生菌對宿主生殖和行為影響的研究[14～15]。近期,針對蜘蛛微生物群落的研究逐漸增多,如:蜘蛛整體細菌群落研究[16～17],基于組織、器官和種群水平的細菌多樣性分析[18～21],蜘蛛腸道微生物與其獵物微生物多樣性比較[18,22]等。但是,我國北方地區蜘蛛細菌群落的比較研究尚未見報道。

環境因素對昆蟲共生菌的傳播起著非常重要的作用[23]。蜘蛛是重要的農林害蟲天敵,廣泛存在于陸地生態系統,易于攜帶大量的共生菌和其他細菌等微生物[17]。不同蜘蛛對蛛絲的利用和捕食方式有所區別,所處的生境和取食的獵物也存在一定差異,因此,其所攜帶微生物的多樣性和群落組成也將受到不同程度的影響。本研究基于16S rRNA測序方法,比較了利氏貓蛛(Oxyopeslicenti;貓蛛科Oxyopidae)、星豹蛛(Pardosaastrigera;狼蛛科Lycosidae)、金黃逍遙蛛(Philodromusaureolus;逍遙蛛科Philodromidae)、三突伊氏蛛(Misumenopstricuspidatus;蟹蛛科Thomisidae)和園蛛(Araneus)sp.1(園蛛科Araneidae)共5種蜘蛛的細菌群落,以期了解蜘蛛所攜帶細菌的多樣性和群落組成與其捕食方式及生存環境的關系。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

蜘蛛樣本于2020年10月中旬采自沈陽市沈北新區蒲河沿岸的社區公園(41°56＇N,123°22＇E)。本研究涉及的5種蜘蛛根據捕食方式不同分屬5個功能群[24],其中,利氏貓蛛(其他游獵Ⅰ型)、金黃逍遙蛛(其他游獵Ⅱ型)、三突伊氏蛛(伏擊型)和園蛛sp.1(圓網型)使用掃網法采自灌木叢,星豹蛛(地表游獵型)使用管扣法采自地表層。5種蜘蛛均屬于非瀕危和非保護物種。每種蜘蛛選取體型接近的10頭個體,單頭保存在小廣口瓶(高5 cm,直徑3 cm)中,瓶中放入浸水的棉花保濕,瓶口塞上干燥的棉花。饑餓兩周之后,將蜘蛛經無水乙醇固定,于-20℃冰箱保存[16]。

1.2 DNA提取、PCR擴增和測序

按照DNeasy PowerSoil Kit(QIAGEN公司,美國)試劑盒的說明書,每種蜘蛛分別提取10頭個體的整體DNA。使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量和完整性,同時使用Nanodrop NC 2000分光光度計(Thermo Fisher Scientific公司,美國)檢測DNA濃度和純度(OD260/OD280比值)。之后隨機選取兩頭同種蜘蛛提取的DNA等摩爾量匯合為一個樣本,以減少測序數據的偶然性[16],每種蜘蛛得到5個DNA樣本。

每個DNA樣本使用16S rRNA V3～V4區通用引物 338F(5＇-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3＇)和 806R(5＇-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3＇)進行PCR擴增。擴增體系共25 μL:5 μL 5×reaction buffer,5 μL 5× GC buffer,2 μL dNTP(2.5 mmol/L),1 μL forward primer(10 μmol/L),1 μL reverse primer(10 μmol/L),2 μL DNA template,0.25 μL Q5 DNA polymerase,8.75 μL ddH2O。PCR 的反應條件為:98℃預變性2 min;98℃變性15 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,循環25次;72℃延伸5 min。擴增產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳純化回收目標片段,合格的產物通過Illumina NovaSeq PE 250平臺進行測序(上海派森諾生物有限公司),用于評估細菌多樣性[25]。

通過QIIME 2軟件(2019.4)[26]中的Divisive Amplicon Denoising Algorithm 2(DADA2)插件對原始數據進行質控、去噪、拼接、去嵌合體[27],以100%相似度進行變異擴增子序列(amplicon sequence variant,ASV)聚類[28],然后根據Greengenes數據庫[29],在Naive Bayes分類器中使用classifysklearn算法對每個ASV特征序列進行物種注釋[30]。

1.3 數據處理與分析

對ASVs進行抽平處理后計算每個樣本的α多樣性,并通過R 3.3.1繪圖進行可視化。α多樣性采用Chao1豐富度指數[31]、Shannon多樣性指數[32]、Simpson優勢度指數[33]和Pielou均勻度指數[34]進行評估,使用Kruskal-Wallis秩和檢驗和Dunn’s test檢驗差異的顯著性。通過線性判別分析效應量[linear discriminant analysis(LDA)effect size,LEfSe]揭示差異顯著且能有效解釋細菌群落差異的指示類群(LDA＞4,P＜0.05)[35],采用非參數Kruskal-Wallis秩和檢驗檢測組間豐度差異的類群,同時通過Wilcoxon秩和檢驗驗證顯著性,最后通過線性判別分析(LDA)對數據進行降維并評估差異顯著的物種的影響力。通過CANOCO 5.0分別在門和屬兩個分類水平對優勢菌群進行主成分分析(principal component analysis,PCA),探討蜘蛛所攜帶細菌的群落組成與其宿主功能群的關系。

2 結果

2.1 測序結果分析

所有樣本共獲得4 645 487條原始序列,經過DADA2進行質控后得到4 219 367條有效序列,平均每個樣本獲得168 775條有效序列。所有的測序結果被分為16 092個ASVs,共34門421科948屬細菌(表1)。其中,采于地表的星豹蛛劃分到的ASVs及注釋到的細菌各分類水平的數量均最多,游獵于灌木叢的金黃逍遙蛛的數量均最少(表 1)。

表1 5種蜘蛛所攜帶細菌的16S rRNA測序基本信息Table 1 Sequence analysis of bacterial 16S rRNA genes from five species of spiders

2.2 不同蜘蛛所攜帶細菌的群落組成分析

在門分類水平上,5種蜘蛛所攜帶細菌的群落組成表現出了較大差異。變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)是5種蜘蛛共有的核心菌門(＞1%)。其中,變形菌門的相對豐度最高,在金黃逍遙蛛中占比高達74.78%,在星豹蛛中的占比最低,但也達到了47.10%;擬桿菌門的相對豐度在5種蜘蛛中較均勻,在利氏貓蛛中最高,為23.85%,在三突伊氏蛛中最低,為15.08%;厚壁菌門的相對豐度在利氏貓蛛、星豹蛛和三突伊氏蛛中超過10.46%,在另兩種蜘蛛中也超過了5.04%。此外,放線菌門(Actinobacteria)和藍細菌門(Cyanobacteria)的相對豐度在星豹蛛中分別高達16.18%和1.41%,而在其他4種蜘蛛中最高分別僅為2.90%和0.43%;軟壁菌門(Tenericutes)的相對豐度在園蛛sp.1中高達12.64%,而在其他4種蜘蛛中最高僅為1.31%(圖1A)。

在屬分類水平上,5種蜘蛛所攜帶細菌的群落組成也表現出了較大差異。相對豐度大于1%的有17屬,土壤桿菌屬(Sediminibacterium)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)、無氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillus)、貪銅菌屬(Cupriavidus)和溶桿菌屬(Lysobacter)是共有的核心菌屬(＞1%)。其中,土壤桿菌屬和蒼白桿菌屬是除金黃逍遙蛛以外的其他4種蜘蛛中相對豐度最高的兩個菌屬,占比分別在13.97%～22.15%和12.75%～20.40%,這兩個屬在金黃逍遙蛛中的相對豐度也分別高達16.74%和14.93%;無氧芽孢桿菌屬、貪銅菌屬和溶桿菌屬的相對豐度在三突伊氏蛛中均最高(11.77%、7.98%和6.54%),在金黃逍遙蛛中均最低(2.03%、1.60%和1.27%)。此外,立克次氏體屬(Rickettsia)和沃爾巴克氏菌屬(Wolbachia)的相對豐度在金黃逍遙蛛中分別高達28.63%和17.57%,在其他4種蜘蛛中均小于0.01%;微桿菌屬(Microbacterium)、紅球菌屬(Rhodococcus)和芽孢桿菌屬(Bacillus)的相對豐度在星豹蛛中分別為3.58%、3.59%和2.68%,在其他4種蜘蛛中最高分別為0.09%、0.02%和0.56%(圖1B)。

2.3 不同蜘蛛所攜帶細菌的α多樣性分析

本文基于ASVs水平比較了5種蜘蛛所攜帶細菌的α多樣性。分析結果表明:Chao1指數在5種蜘蛛間不存在顯著差異(P＞0.05)。星豹蛛的Shannon指數和Pielou均勻度指數極顯著高于金黃逍遙蛛(P＜0.01),顯著高于園蛛sp.1(P＜0.05);兩個指數在星豹蛛與利氏貓蛛、三突伊氏蛛之間,以及星豹蛛以外的其他4種蜘蛛之間不存在顯著差異(P＞0.05)。星豹蛛的Simpson指數僅顯著高于金黃逍遙蛛(P＜0.05);Simpson指數在星豹蛛以外的其他4種蜘蛛之間不存在顯著差異(P＞0.05)(圖2)。

圖2 5種蜘蛛所攜帶的細菌α多樣性差異分析OX:利氏貓蛛;PA:星豹蛛;PH:金黃逍遙蛛;MI:三突伊氏蛛;AR:園蛛sp.1.*:P＜0.05,**:P＜0.01。Fig.2 Variance analysis of the α-diversity index of bacteria among five species of spidersOX:Oxyopes licenti;PA:Pardosa astrigera;PH:Philodromus aureolus;MI:Misumenops tricuspidatus;AR:Araneus sp.1.*:P＜0.05,**:P＜0.01.

2.4 不同蜘蛛所攜帶菌群的差異分析

為比較不同蜘蛛所攜帶細菌的差異,采用LEfSe分析來發掘相對豐度存在顯著差異的類群(LDA＞4,P＜0.05)。分析結果顯示,星豹蛛和金黃逍遙蛛所攜帶的細菌中存在相對豐度具有顯著差異的菌群。星豹蛛中的放線菌門、放線菌綱(Actinobacteria)、放線菌目(Actinomycetales)、微桿菌科(Microbacteriaceae)、微桿菌屬和芽孢桿菌屬顯著高于其他4種蜘蛛;金黃逍遙蛛中的立克次氏體科(Rickettsiaceae)、立克次氏體屬和沃爾巴克氏菌屬顯著高于其他4種蜘蛛(圖3)。

圖3 5種蜘蛛所攜帶細菌的LEfSe分析PA:星豹蛛;PH:金黃逍遙蛛。圖中僅顯示LDA＞4、P＜0.05時差異顯著的結果。Fig.3 LEfSe analysis of the bacteria among five species of spidersPA:Pardosa astrigera;PH:Philodromus aureoles.Only the results with significant difference(P＜0.05)when LDA＞4 are shown in the figure.

2.5 不同功能群蜘蛛優勢菌群的PCA分析

為探討蜘蛛所攜帶細菌的群落組成與其宿主功能群的關系,在門和屬兩個分類水平對蜘蛛優勢菌群進行了PCA分析排序(圖4)。在門分類水平,第一軸和第二軸分別解釋了49.72%和28.70%的變異信息(累計78.42%),地表游獵型的星豹蛛與采自灌木叢的其他4種功能群蜘蛛的優勢菌門差異較大,放線菌門與其相關性最高;在采自灌木叢的4種功能群蜘蛛中,軟壁菌門與圓網型的相關性最高,變形菌門與其他游獵Ⅱ型的相關性更高(圖4A)。在屬分類水平,第一軸和第二軸分別解釋了48.43%和26.43%的變異信息(累計74.86%),其他游獵Ⅱ型的金黃逍遙蛛與其他4種功能群蜘蛛的優勢菌屬差異較明顯,沃爾巴克氏菌屬和立克次氏體屬與其相關性最高;紅球菌屬和芽孢桿菌屬與地表游獵型的星豹蛛相關性最高(圖4B)。

圖4 不同功能群蜘蛛優勢菌群的主成分分析(A)門;(B)屬。OTH-Ⅰ:其他游獵Ⅰ型;GRH:地表游獵型;OTH-Ⅱ:其他游獵Ⅱ型;AMH:伏擊型;ORW:圓網型。Fig.4 Principal component analysis of dominant bacteria among different guilds of spiders(A)Phylum;(B)Genus.OTH-Ⅰ:Other huntersⅠ;GRH:Ground hunters;OTH-Ⅱ:Other huntersⅡ;AMH:Ambush hunters;ORW:Orb web.

3 討論

本研究比較了5種蜘蛛所攜帶細菌的多樣性和組成差異,16S rRNA序列共注釋到34門421科948屬細菌。采于地表的星豹蛛所攜帶細菌的各分類水平數量均最高,為23門190科345屬,最低的金黃逍遙蛛也達到了21門141科246屬,高于以往大部分蜘蛛微生物相關研究結果[16～17]。

以往研究發現,宿主的生活環境和食物可以影響其共生菌及腸道微生物[22,36～38],這在本研究中也得到了部分證實。在門分類水平,本研究發現變形菌門的相對豐度在5種蜘蛛中均最高,是蜘蛛所攜帶的細菌群落中優勢度最高的門。這一結果與以往很多節肢動物有關的研究結果相似,如:Zhang等[16～17]發現變形菌門在多種蜘蛛共生菌中相對豐度最高;Hu等[21]報道變形菌門在溝渠豹蛛(Pardosalaura)、星豹蛛和白斑隱蛛(Nursciaalbofasciata)的腸道菌群中相對豐度最高。此外,變形菌門也是灰飛虱(Laodelphaxstriatellus)[38]、橘二叉蚜(Aphisaurantii)[39]、中華通草蛉(Chrysoperlasinica)成蟲[40]、荔枝蝽(Tessaratomapapillosa)[41]和日本龜蠟蚧(Ceroplastesjaponicus)[42]等多種昆蟲共生菌群落中相對豐度最高的門。本研究結果顯示,放線菌門的相對豐度在地表游獵型星豹蛛中高達16.18%,而在采自灌木叢的其他4種蜘蛛中最高僅為2.90%,證明了環境因素對蜘蛛所攜帶細菌群落具有重要作用。Zhang等[16]發現,變形菌門的相對豐度在采自武漢不同地點的迷宮漏斗蛛(Agelenalabyrinthica)(98.86%)和機敏漏斗蛛(Agelenadifficilis)(13.86%)之間存在著巨大差異,這也證實了環境因素的影響。此外,本研究發現,軟壁菌門的相對豐度在圓網型園蛛sp.1中最高,為12.64%,而在同樣采自灌木叢的其他3種蜘蛛中最高僅為1.31%,推測這是不同功能群蜘蛛獵取的食物不同造成的。向禮波等[43]也認為,食性是影響東亞鉗蝎(Buthusmartensii)和西藏琵蝎(Scorpiopstibetanus)腸道優勢菌屬的重要因素。

在屬分類水平,蒼白桿菌屬和土壤桿菌屬的相對豐度在本研究的5種蜘蛛中均超過12%,前者與Hu等[21]在溝渠豹蛛、星豹蛛和白斑隱蛛腸道細菌中的分析結果相似,而后者在以往關于蜘蛛細菌群落的研究中占比均較低,最高僅為2.03%[16～17,21]。立克次氏體屬和沃爾巴克氏菌屬是多種蜘蛛細菌群落的核心菌群[2,13,16～17],它們在本研究的金黃逍遙蛛中是優勢度最高的兩個菌屬,然而,這兩個菌屬的相對豐度在同樣采自灌木叢的其他3種蜘蛛和采于地表的星豹蛛中均小于0.01%。這與Goodacre等[2]在多種蜘蛛中發現的這兩個菌屬分布不均的結果相似。王振宇等[44]認為,沃爾巴克氏菌屬分布不均勻與蜘蛛自身條件、行為,以及沃爾巴克氏菌的傳播效率有關。同時,本研究發現,紅球菌屬、微桿菌屬和芽孢桿菌屬是地表游獵的星豹蛛的核心菌群,但在采自灌木叢的其他4種蜘蛛中的相對豐度均很低。上述結果從屬的分類水平再次支持了,環境因素和不同的食物對蜘蛛所攜帶細菌的群落組成的重要性。

在多樣性分析結果中,星豹蛛所攜帶細菌的各α多樣性指數均最高,其中Shannon指數和Pielou均勻度指數顯著高于金黃逍遙蛛和園蛛sp.1,Simpson指數顯著高于金黃逍遙蛛(P＜0.05);而采自同一灌木叢的其他4種蜘蛛的各α多樣性指數的差異均較小(P＞0.05)。以上信息說明,環境因素對蜘蛛所攜帶細菌的α多樣性有重要影響。

通過比較不同蜘蛛所攜帶細菌的組成及多樣性,我們發現,活動范圍廣、接觸環境復雜的星豹蛛(地表游獵型)的細菌群落組成差異較大,多樣性最高,說明環境是影響蜘蛛菌群的重要因素;同處于灌木叢的4種功能群蜘蛛的細菌群落組成也存在一定差異,推測是蜘蛛獵取的食物不同造成的。總的來講,本研究工作對進一步了解蜘蛛的細菌群落及其影響因素有參考價值,但其影響機制和細菌對蜘蛛的影響等方面還有待進一步研究。