太赫茲技術(shù)在膠質(zhì)瘤診療中的應(yīng)用:從組織分級到分子分型*

穆寧 楊川艷 馬康 全玉蓮 王詩 賴穎 李飛 王與燁 陳圖南? 徐德剛 馮華

1) (陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,重慶 400038)

2) (天津大學(xué)精密儀器與光電子工程學(xué)院,天津 300072)

太赫茲波(terahertz,THz)是位于微波和紅外之間介觀尺度波長的電磁波,因其低電離性和指紋性的特點(diǎn),在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力,尤其是在腫瘤的術(shù)中定位定性診斷方面.而對于定位定性診斷需求最迫切的腫瘤為膠質(zhì)瘤,因其侵襲性和異質(zhì)性,切除后極易復(fù)發(fā)且對臨近腦區(qū)神經(jīng)功能有顯著影響,快速確定瘤體邊界以及腫瘤病理學(xué)特征,是開展膠質(zhì)瘤精準(zhǔn)診療和臨床研究的重要前提.本文總結(jié)了膠質(zhì)瘤診斷的生物物理技術(shù),梳理了太赫茲波這一新興技術(shù)在膠質(zhì)瘤診斷方面所取得的研究成果.進(jìn)一步,基于膠質(zhì)瘤組織病理和分子病理整合診斷研究進(jìn)展,提出不同分子分型腫瘤組織在太赫茲波段可能具有不同 “特異性蛋白組成”的太赫茲腫瘤亞型識別機(jī)制假說,結(jié)合腦組織生物學(xué)特點(diǎn)與體液中膠質(zhì)瘤標(biāo)志物檢測潛力,全面設(shè)想了未來太赫茲波在膠質(zhì)瘤臨床診療中的應(yīng)用模式和發(fā)展前景.

1 引言

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性實(shí)體瘤,惡性膠質(zhì)瘤具有高度的侵襲性和異質(zhì)性,在神經(jīng)功能豐富而重要結(jié)構(gòu)密集的大腦中可不斷生長,而被破壞的中樞神經(jīng)系統(tǒng)又難以實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)再生和功能重建,其后果是惡性膠質(zhì)瘤患者的身心殘疾率高、生存期短且生存質(zhì)量差[1].與絕大多數(shù)實(shí)體瘤治療策略類似,盡可能精準(zhǔn)地切除瘤體是膠質(zhì)瘤目前得到有效控制的基礎(chǔ),而精準(zhǔn)手術(shù)的前提是精準(zhǔn)的識別[2].目前,盡管現(xiàn)有的神經(jīng)腫瘤檢測技術(shù)和儀器較好地解決了術(shù)前腫瘤的定位問題,但對于術(shù)中診斷與病灶識別,特別是面對浸潤型神經(jīng)腫瘤的深度、邊界與分子分型精準(zhǔn)識別,始終缺乏快捷而有效的技術(shù)手段.因此,發(fā)展快速定位和定性診斷技術(shù)為目前腫瘤研究的熱點(diǎn)之一.為了實(shí)現(xiàn)膠質(zhì)瘤的精準(zhǔn)識別,多個領(lǐng)域?qū)＜揖鶎⑻掌澆ㄗV與成像列為了重要的候選方案.

太赫茲(terahertz,THz)波因其低電離、無標(biāo)記、指紋性等特性廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究[3,4].太赫茲時域光譜(terahertz time-domain spectroscopy,THz-TDS)可反映生物樣品的分子集體的非對稱性振動/轉(zhuǎn)動和極性基團(tuán)振動/轉(zhuǎn)動引起的偶極矩的變化,獲得特異性介電參數(shù);同時在復(fù)雜生物組織檢測中,由于太赫茲波的單光子能量較低且對水吸收敏感,其光譜成像可以安全有效地反映不同生物組織成分結(jié)構(gòu)的宏觀整體差異.因此,近幾年太赫茲技術(shù)在腫瘤病灶區(qū)域定位及病理學(xué)定性快速檢測方面得到了大量應(yīng)用研究[5-14].

本綜述主要圍繞太赫茲技術(shù)在膠質(zhì)瘤診斷的研究進(jìn)展和展望,分為以下幾個部分: 1) 總結(jié)當(dāng)前膠質(zhì)瘤診斷的生物物理技術(shù)及其局限性;2) 簡要回顧應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的太赫茲探測技術(shù),以及基于太赫茲光譜成像技術(shù)在膠質(zhì)瘤診斷方面所取得的研究成果,進(jìn)而提出不同分子分型腫瘤組織在太赫茲波段可能具有不同“特異性蛋白組成”的太赫茲腫瘤亞型識別機(jī)制假說;3) 結(jié)合膠質(zhì)瘤腦組織生物學(xué)特點(diǎn)和體液中膠質(zhì)瘤標(biāo)志物,探討太赫茲波在膠質(zhì)瘤檢測中的臨床應(yīng)用模式和前景.

2 膠質(zhì)瘤客觀診斷技術(shù)需求與現(xiàn)實(shí)局限

2.1 膠質(zhì)瘤疾病特性決定了其對“同步定位定性”的高度精準(zhǔn)診斷需求

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)腫瘤,其發(fā)病率大約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的80%[15].即使采用標(biāo)準(zhǔn)化的治療,膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后仍不容樂觀[1].由于腦膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長,當(dāng)腫瘤毗鄰或累及神經(jīng)功能結(jié)構(gòu)時,即便應(yīng)用手術(shù)顯微技術(shù),也不能達(dá)到既安全切除腫瘤、又不損傷神經(jīng)結(jié)構(gòu)的理想狀態(tài).因此,實(shí)現(xiàn)膠質(zhì)瘤精準(zhǔn)切除是當(dāng)前神經(jīng)外科診治最基本的目標(biāo).這就要求術(shù)中實(shí)現(xiàn)膠質(zhì)瘤的“定位”及“定性”: 定位需要實(shí)現(xiàn)的是變腫瘤邊界的不可見為可見,定性需要實(shí)現(xiàn)腫瘤病理性質(zhì)的不可見為可見;實(shí)現(xiàn)了腫瘤位置和性質(zhì)的“可見”,就有可能以手術(shù)為起點(diǎn),開展包括手術(shù)策略、綜合診療策略上的精準(zhǔn)診療.

當(dāng)前臨床腫瘤定性主要依賴于病理學(xué)方法.根據(jù)腫瘤組織的形態(tài)學(xué)特征(細(xì)胞性質(zhì)、核分裂、核異型、微血管增殖和壞死等)可將神經(jīng)膠質(zhì)瘤分為1—4 級[15,16];這種組織學(xué)分級是判斷和區(qū)分不同神經(jīng)膠質(zhì)瘤預(yù)后的傳統(tǒng)手段,也是確定治療方案的重要依據(jù).但在長期使用過程中,這種組織病理分型的不足也逐漸顯現(xiàn),首先這種分型主要依據(jù)膠質(zhì)瘤在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)基礎(chǔ)上再輔以免疫組化技術(shù),更多的是依靠病理科醫(yī)師的主觀觀察,然而組織學(xué)觀察者的判讀可能存在差異[17];其次,膠質(zhì)瘤細(xì)胞存在多樣性,導(dǎo)致組織病理學(xué)診斷結(jié)果可能囊括不同的細(xì)胞亞群,而不同亞型的腫瘤細(xì)胞可能帶來顯著差異的疾病預(yù)后,僅僅依賴組織分型無法做到盡可能細(xì)致的判斷[2,15,18-20].2016 年,世界衛(wèi)生組織中樞神經(jīng)系統(tǒng)(World Health Organization-Central Nervous System,WHO-CNS)納入了異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)、地中海貧血/智力低下基因(Alpha Thalassemia/mental Retardation syndrome X-linked gene,ATRX)、染色體1p 和19q 雜合性缺失(lp/19q loss of heterozygosity,lp/19q LOH)等分子標(biāo)志物,在腫瘤分類中結(jié)合腫瘤組織病理及其分子病理信息,使相關(guān)診斷水平有所提高.這標(biāo)志著中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤診斷進(jìn)入“整合”診斷時代[20,21](圖1).因此,快速提取腫瘤分子病理特征是膠質(zhì)瘤準(zhǔn)確診斷和臨床研究的重要依據(jù),也是提高臨床治療效果的重要前提[16,22].

圖1 基于“組織病理”和“分子病理”聯(lián)合診斷標(biāo)準(zhǔn) (a) 腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征;(b) 膠質(zhì)瘤分子分型Fig.1.Based on a combination of histopathology and molecular pathology: (a) Morphological characteristics of tumor cells;(b) molecular typing of gliomas.

腫瘤的定位主要依賴影像學(xué)方法.由于影像學(xué)“定位”和病理學(xué)“定性”無法完美結(jié)合,當(dāng)前臨床上主要依賴影像學(xué)技術(shù)行手術(shù)前規(guī)劃,依靠可見光波段顯微鏡進(jìn)行手術(shù),當(dāng)手術(shù)中腫瘤邊界區(qū)域難以抉擇時,往往根據(jù)術(shù)者經(jīng)驗(yàn)判斷,先行切除少量臨界組織進(jìn)行快速(15—60 min)術(shù)中病理檢測來獲得初步定性提示,再根據(jù)提示判斷是否已經(jīng)到達(dá)腫瘤邊界.即便如此“粗略”,由于缺乏“定性同時定位”的技術(shù),該模式已然成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最優(yōu)的選擇和應(yīng)用最廣的方法.

在臨床治療和研究過程中,快速獲取膠質(zhì)瘤定位及定性信息,是開展膠質(zhì)瘤精準(zhǔn)診療和臨床研究的重要前提.盡可能早地獲取腫瘤分子分型信息,將帶來一系列重要的臨床進(jìn)展.1) 彌補(bǔ)術(shù)中快速病理檢測的局限: 在手術(shù)中,部分患者組織病理學(xué)未見某種特定腫瘤大體特征,但依據(jù)其分子特點(diǎn),仍可做出診斷,輔助手術(shù)決策(如存在IDH 突變、1p/19q 共缺失,則高度提示少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤的診斷結(jié)果);2) 輔助手術(shù)策略的制定: 例如,IDH 突變型膠質(zhì)瘤術(shù)后預(yù)后良好,在手術(shù)實(shí)行全切方案最佳,若術(shù)中快速獲取的這一結(jié)果,可供主刀醫(yī)師進(jìn)行術(shù)中決策;3) 術(shù)中精準(zhǔn)劃定腫瘤邊界: 膠質(zhì)瘤具有極強(qiáng)的侵襲性和異質(zhì)性,依據(jù)視覺判斷和影像導(dǎo)航難以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的邊界識別,多切造成殘疾、少切極易復(fù)發(fā),術(shù)中快速病理,可以實(shí)現(xiàn)神經(jīng)醫(yī)生“定位同時定性”的術(shù)中病理學(xué)邊界劃定追求;4) 為術(shù)后綜合治療方案的制定提供更早、更全面的分子病理學(xué)依據(jù).

2.2 現(xiàn)有定位定性技術(shù)及其局限性

當(dāng)前主流的膠質(zhì)瘤“定位定性”技術(shù)如圖2 所示,主要分為影像學(xué)技術(shù)與病理學(xué)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)等,表1 重點(diǎn)闡述這些技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn).

表1 當(dāng)前膠質(zhì)瘤臨床診斷方法Table 1. Current clinical diagnosis of glioma.

圖2 膠質(zhì)瘤診斷方法Fig.2.Diagnostic methods for glioma.

2.2.1 影像學(xué)技術(shù)

電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(computed tomography,CT)[23,24]又稱X 射線電子計(jì)算機(jī)斷層掃描儀,分為平掃和增強(qiáng)掃描,具有高分辨率、無前后重疊、病灶細(xì)節(jié)清晰、分期準(zhǔn)確、掃描時間短等諸多優(yōu)點(diǎn).CT 可顯示顱內(nèi)占位性病變,能較清楚的對比分析術(shù)后滲血或積血,因此該技術(shù)可減少積血對膠質(zhì)瘤術(shù)后影像學(xué)診斷所受的干擾;可有效檢測腦組織血流動力學(xué)改變及腫瘤內(nèi)部微血管改變,對鑒別良惡性腫瘤及對腫瘤分級有較重要的意義;但是相較于磁共振(magnetic resonance imaging,MRI),其對軟組織分辨率低,同時成像參數(shù)少,可獲得的診斷信息有限,因此單獨(dú)應(yīng)用CT 發(fā)生誤診或漏診的風(fēng)險(xiǎn)較大;CT 增強(qiáng)則需要注射造影劑,但部分患者對造影劑過敏;另外,CT 也具有一定的放射性損害,可能引起醫(yī)源性傷害.

正電子發(fā)射斷層成像—X 線計(jì)算機(jī)斷層成像儀(positron emission tomography-computed tomography,PET-CT)[25]是一種將PET 和CT 拼接在一起的診斷技術(shù),CT 主要顯示病灶的形態(tài)結(jié)構(gòu)信息,PET 具有測定腫瘤代謝水平的能力,PETCT 掃描將兩者結(jié)合,提高了診斷的準(zhǔn)確性.PETCT 在判斷膠質(zhì)瘤良惡性、殘留情況、以及鑒別腫瘤復(fù)發(fā)和放射性壞死具有一定的意義,其缺點(diǎn)主要有: 1) PET-CT 輻射較大(10—15 mSv/次),一部分是CT 檢查出現(xiàn)的X 射線,另一部分則是氟代脫氧葡萄糖(fludeoxyglucose,FDG)等示蹤劑造成的伽馬射線;2) 價(jià)格昂貴.

單光子排放計(jì)算斷層掃描(single photon emission computed tomography,SPECT)實(shí)際上是一種由CT 與核醫(yī)學(xué)示蹤原理相結(jié)合的影像技術(shù).對判斷膠質(zhì)瘤惡性程度可提供一定的幫助,價(jià)格較便宜,輻射劑量也較少,但其空間分辨率及特異性不及PET-CT.

磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)[26,27]是膠質(zhì)瘤影像學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn).以其優(yōu)良的軟組織分辨率在腦腫瘤檢查中發(fā)揮了十分重要的作用.在生物組織發(fā)生病變時,其含水量會發(fā)生相應(yīng)的改變,磁共振可靈敏地探測出這種差異[28];相較于CT,MRI 具有較高的圖像分辨率,且MRI為多參數(shù)、多角度成像,清晰度和對比度高,偽影影響小,可實(shí)現(xiàn)腫瘤冠狀面、矢狀面、橫斷面等多方位成像,顯示腫瘤病灶及周圍組織、血管的關(guān)系,提高膠質(zhì)瘤檢出率及定位定性準(zhǔn)確性.但是術(shù)區(qū)腦組織在術(shù)后會伴隨有水腫及積血等情況;受此干擾,MRI 影像較為混雜.同時MRI 診斷也存在一定客觀局限性: 1) 組織移動性;2) 如果患者存在金屬心臟瓣膜、金屬物體、迷走神經(jīng)刺激器、子彈彈片等,則無法進(jìn)行MRI 檢查;3) 補(bǔ)牙使用的填充物和支撐物會影響頭顱MRI 成像的質(zhì)量;4) 幽閉恐懼癥、兒童等患者無法忍受密閉性MRI,須在鎮(zhèn)定劑作用下進(jìn)行MRI 檢查.

除此之外,術(shù)中影像學(xué)診斷還發(fā)展了多光子顯微術(shù)[29,30]、以及基于5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,5-ALA)誘導(dǎo)的原卟啉IX (protoporphyrin IX)熒光光譜診斷成像技術(shù)[31,32].這些技術(shù)價(jià)格相對低廉,且可以有效識別高級別膠質(zhì)瘤,但是對低級別膠質(zhì)瘤不敏感.科學(xué)家們嘗試開發(fā)更多的新興技術(shù),如從紫外到近紅外光譜范圍的光譜學(xué)[33-35]、拉曼光譜和成像[36]以及光聲成像[14]、太赫茲光譜成像等.

2.2.2 病理學(xué)技術(shù)

組織病理學(xué)診斷是最理想、最可靠的診斷依據(jù),是腫瘤定性診斷的金標(biāo)準(zhǔn).通過病理檢測對疾病進(jìn)行判定,為臨床治療提供可靠的科學(xué)依據(jù).目前常用方法主要有術(shù)中快速蘇木素-伊紅染色(hematoxylin and eosin staining,HE)切片和術(shù)后免疫組化.1) 術(shù)中冰凍病理HE: 由于膠質(zhì)瘤的異質(zhì)性,在術(shù)中病理檢查時需要考慮盡可能多的部位,進(jìn)行快速HE 切片,根據(jù)細(xì)胞形態(tài)等特征進(jìn)行判斷.盡管術(shù)中病理檢查可以快速(大約30 min)確定有無癌組織殘留,但也存在一定的局限: 冰凍病理切片的質(zhì)量與常規(guī)石蠟切片有一定差距,準(zhǔn)確率只有90%,存在誤診和漏診的可能性,且只有經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)生才能夠進(jìn)行冰凍病理診斷;冰凍切片取材十分局限,局部組織難以代表整個腫瘤的全貌,且膠質(zhì)瘤的侵襲性強(qiáng),術(shù)中組織運(yùn)動難以準(zhǔn)確跟蹤[14],須考慮較多的檢查部位,不僅費(fèi)時,而且加大了病理醫(yī)師的工作量,從而難以準(zhǔn)確地選擇病理檢查部位;術(shù)中診斷沒有免疫組化等輔助手段,部分病變僅憑形態(tài)學(xué)特征并不能明確作出診斷.2) 免疫組化診斷: 通過對活檢或手術(shù)切除的腫瘤組織切片,結(jié)合相關(guān)抗體進(jìn)行染色觀察;對于膠質(zhì)瘤而言,術(shù)后的免疫組化可進(jìn)一步確定分子分型等信息,為臨床提供治療方案的選擇;但免疫組化技術(shù)具有抗體特異性及穩(wěn)定性不足、工作量大、病理結(jié)果滯后等局限性.

2.2.3 分子生物學(xué)技術(shù)

目前,實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)技術(shù)則主要有聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)、熒光原位雜交(fluorescencein situhybridization,FISH)、生物芯片、基因檢測及測序等.

1) 聚合酶鏈反應(yīng).實(shí)時熒光定量PCR 是現(xiàn)在最普遍的檢測技術(shù),其操作簡單,結(jié)果可靠,在生物實(shí)驗(yàn)中得到了廣泛應(yīng)用.其原理是在目的基因區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針,當(dāng)探針和序列結(jié)合時,DNA聚合酶將熒光淬滅基團(tuán)切斷從而發(fā)出熒光,其假陽性低,成本也低.

2) 原位熒光雜交.該方法是最常用的原位檢測方式,能夠檢測如細(xì)胞、組織和小型生物體等不同水平樣本的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP).

3) 生物芯片.屬于微型生物化學(xué)分析系統(tǒng),能檢測不同時空條件下的基因變化;能顯示反應(yīng)特征性的組織類型、發(fā)育階段和環(huán)境應(yīng)答等.

4) 基因檢測及測序.近十年來,基因組學(xué)及基因測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于臨床,并在個體化醫(yī)療中優(yōu)勢明顯.應(yīng)用高通量測序技術(shù)(next generation sequencing,NGS)對腫瘤細(xì)胞基因組測序,并通過數(shù)據(jù)庫比對關(guān)聯(lián)腫瘤與特定基因,不僅有助于診斷分類,更有助于進(jìn)一步深刻地理解各類型膠質(zhì)瘤的生物學(xué)信息,為研發(fā)新的抗腫瘤藥物、指導(dǎo)治療方案并對預(yù)后判斷提供強(qiáng)有力的依據(jù),最終為膠質(zhì)瘤患者制定最佳的個體化治療方案.Sanger 法測序是目前檢測腫瘤基因突變的金標(biāo)準(zhǔn),靈敏度僅有20%左右,且基因檢測、焦磷酸測序檢測平臺準(zhǔn)入成本高、經(jīng)驗(yàn)及人才缺乏,對于大多數(shù)病患而言高昂的自費(fèi)檢查難以承擔(dān).

定位定性存在時空差異性也是上述診斷技術(shù)最大的術(shù)中應(yīng)用缺陷.近年來,以太赫茲光譜成像、拉曼光譜成像為代表的無標(biāo)記分子光譜檢測技術(shù)將電磁波作為激發(fā)媒介,光散射能量譜作為表征手段,通過對樣品中固有生物大分子的振動/轉(zhuǎn)動能級信息進(jìn)行直接測量,實(shí)現(xiàn)特異性“指紋識別”表征;適用于腫瘤組織診斷.太赫茲波因其高空間分辨率和水敏感等特性,廣泛應(yīng)用于膠質(zhì)瘤組織、細(xì)胞、特征性分子等的識別,實(shí)現(xiàn)膠質(zhì)瘤診斷影像學(xué)“定位”和病理學(xué)“定性”同步.同時,太赫茲技術(shù)在膠質(zhì)瘤術(shù)中診斷中還具有以下優(yōu)勢: 1) 太赫茲技術(shù)可解決術(shù)中組織移位問題,傳統(tǒng)的術(shù)中導(dǎo)航即基于定位系統(tǒng)引導(dǎo)下將探針引入腦內(nèi),可能會造成組織移位,而太赫茲技術(shù)有望突破這一限制;2) 太赫茲波具有無損、無標(biāo)記等特征,因此它不受造影劑、光透明劑、時間窗口、熒光素酶的限制,可快速檢測不清楚的腫瘤邊界,為疾病預(yù)后提供完整的腫瘤切除.由此可見,太赫茲波有望成為以神經(jīng)腫瘤為代表的實(shí)體腫瘤術(shù)中“定位同時定性”識別的新型、快速、無標(biāo)記診斷方法.

3 太赫茲探測技術(shù)在膠質(zhì)瘤診斷中的應(yīng)用研究

太赫茲波因其安全、水敏感、指紋性、無標(biāo)記等特點(diǎn),廣泛應(yīng)用于腫瘤診斷[3,4,7].擬通過以下兩個方面系統(tǒng)梳理太赫茲技術(shù)在膠質(zhì)瘤檢測中的應(yīng)用: 一是檢測技術(shù)方面,分析當(dāng)前最常應(yīng)用于腫瘤檢測的太赫茲檢測模式,并對目前應(yīng)用于腫瘤的相關(guān)研究進(jìn)行了整理;二是檢測效果方面,將重點(diǎn)闡述太赫茲光譜成像在膠質(zhì)瘤診斷中的研究進(jìn)展.

3.1 太赫茲光譜技術(shù)及其在腫瘤檢測中的應(yīng)用

根據(jù)太赫茲源產(chǎn)生方式的不同,太赫茲光譜系統(tǒng)主要分為太赫茲時域光譜和太赫茲頻域光譜.其中太赫茲時域光譜系統(tǒng)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛,該系統(tǒng)主要由飛秒激光器、光電導(dǎo)探測器、測量模塊(透射式、反射式、衰減全反射)等裝置組成.其中最核心部分為飛秒激光器,它很大程度上決定了THz-TDS 的信噪比和動態(tài)范圍.根據(jù)太赫茲波與樣本作用機(jī)理的不同,太赫茲時域光譜系統(tǒng)可以分為透射、反射、衰減全反射三大類(圖3),具體特點(diǎn)描述見3.1.1 節(jié)和3.1.2 節(jié).在該系統(tǒng)中,飛秒激光器產(chǎn)生的激光脈沖經(jīng)過分束分成兩路,一路作為信號用于產(chǎn)生太赫茲波進(jìn)而進(jìn)行樣品探測,另一路作為參考用于信號光的探測.信號路的飛秒激光被聚焦到光電導(dǎo)天線產(chǎn)生太赫茲脈沖,太赫茲脈沖在光路中通過樣品并攜帶樣品的信息;參考路的飛秒激光經(jīng)過延遲線與攜帶樣品信息的太赫茲脈沖一起到達(dá)電光探測晶體碲化鋅(ZnTe),從而實(shí)現(xiàn)太赫茲波的探測.THz-TDS 技術(shù)相對于傳統(tǒng)的傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared,FTIR)技術(shù)有以下優(yōu)勢: 1) 基于相干探測技術(shù),可以同時測得物質(zhì)的相位信息和強(qiáng)度信息,并得到樣品在太赫茲波段的介電響應(yīng)信息;2) 太赫茲源的功率較高,可以在常溫下工作,信噪比和穩(wěn)定性高,同時其光譜的動態(tài)范圍較大,頻率分辨率高;3) 太赫茲波對水、蛋白質(zhì)等生物大分子十分敏感,且太赫茲波對許多生物大分子具有指紋譜特性.基于上述優(yōu)點(diǎn),可以利用THz-TDS 技術(shù)實(shí)現(xiàn)對生物病變組織和細(xì)胞的檢測,該方法受到研究學(xué)者的廣泛關(guān)注.表2 整理了近10 年太赫茲光譜技術(shù)在腫瘤診斷中的應(yīng)用.

表2 近10 年太赫茲技術(shù)在腫瘤診斷中的工作模式Table 2. Patterns of THz technique in tumor diagnosis over the last 10 years.

圖3 太赫茲光譜檢測技術(shù) (a) 透射式太赫茲光譜系統(tǒng);(b) 反射式太赫茲光譜系統(tǒng);(c)衰減全反射太赫茲光譜系統(tǒng)Fig.3.Terahertz spectral detection technology: (a) Transmitted THz spectral system;(b) reflected THz spectral system;(c) attenuated total reflection THz spectral system.

3.1.1 透射式太赫茲光譜系統(tǒng)

對于低吸收的材料如高透明的固體等,太赫茲波穿透這些物質(zhì)后衰減很小,一般采用透射式的探測方法對其進(jìn)行檢測[37].典型的透射式太赫茲時域系統(tǒng)的原理是: 激光器發(fā)出脈寬飛秒量級的激光脈沖經(jīng)過分光鏡后被分成兩束,分別為泵浦光和探測光;其中泵浦光用于產(chǎn)生太赫茲脈沖,然后經(jīng)過拋物面鏡及透鏡的作用聚焦到樣品表面,透過樣品的太赫茲波束被探測器收集,在光學(xué)延遲平移臺的調(diào)控下,和相干的探測光束一起聚焦在探測器上進(jìn)行光電導(dǎo)探測,經(jīng)過鎖相放大器后讀出攜帶樣品信息的太赫茲時域波形.近10 年來,學(xué)者們先后用該系統(tǒng)對基底細(xì)胞癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌等組織進(jìn)行檢測[38-45].

3.1.2 反射式和衰減全反射式太赫茲時域光譜

對于反射式太赫茲時域光譜,其檢測樣品主要為高吸收的材料如厚的固體材料和溶液等,由于太赫茲系統(tǒng)的功率和動態(tài)范圍有限,透射式方法檢測得到的結(jié)果很不理想,這種情況下可使用反射式的探測方法.反射式與透射式太赫茲系統(tǒng)的區(qū)別在于太赫茲波束傳播的光路不同.除此之外,當(dāng)太赫茲波從光密介質(zhì)入射到光疏介質(zhì),且入射到樣品中的入射角大于臨界角時,也會發(fā)生衰減全反射,系統(tǒng)則變?yōu)樗p全反射測量.衰減全反射系統(tǒng)探測原理是: 當(dāng)太赫茲波進(jìn)入棱鏡內(nèi),在棱鏡-樣品面上發(fā)生全內(nèi)反射而產(chǎn)生倏逝波,界面上的倏逝波與樣品相互作用,反射到棱鏡出射面的光波攜帶了樣品信息,經(jīng)棱鏡-空氣界面折射后,水平射出到檢測器上;

此時,出射的太赫茲波束主要攜帶了樣品的相關(guān)信息,通過分析太赫茲波信號,可以獲得樣品的太赫茲物理化學(xué)性質(zhì).近10 年來,學(xué)者們先后通過優(yōu)化太赫茲反射系統(tǒng),檢測了肝癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、惡性黑色素瘤、乳腺癌、皮膚病、膠質(zhì)瘤等[46-53],證明了該檢測系統(tǒng)在腫瘤診斷的應(yīng)用價(jià)值及優(yōu)勢.

3.2 太赫茲波成像技術(shù)及其在腫瘤研究中的應(yīng)用

隨著太赫茲波譜檢測技術(shù)的不斷發(fā)展,出現(xiàn)了各種原理和結(jié)構(gòu)的太赫茲成像裝置.根據(jù)太赫茲源的不同,太赫茲成像可以分為連續(xù)波成像[54]和脈沖成像[55];根據(jù)成像模式的不同,太赫茲成像可以分為透射式[56]、反射式、衰減全反射[57]等.

連續(xù)波太赫茲成像根據(jù)物體內(nèi)部缺陷或損傷邊緣對太赫茲光的散射效應(yīng),從而影響太赫茲波電磁場的強(qiáng)度分布.在檢測過程中,樣品放在太赫茲源的焦點(diǎn)處,將太赫茲源或樣品固定在X-Y二維平移臺上,通過計(jì)算機(jī)控制平移臺,實(shí)現(xiàn)太赫茲源相對樣品的移動.計(jì)算機(jī)采集樣品表面或金屬底板透射或反射回的強(qiáng)度信息,實(shí)現(xiàn)對樣品不同點(diǎn)的成像,獲得樣品的二維圖像.

脈沖式太赫茲成像則是在THz-TDS 的基礎(chǔ)上利用二維移動平臺控制樣品的移動,在每個位置得到的時域波形即為脈沖式太赫茲成像的像素信息.后期可以將時域波形或計(jì)算得到的折射率、吸收系數(shù)等參數(shù)作為像素信息對圖像進(jìn)行重構(gòu).表2總結(jié)了近10 年太赫茲成像技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用,實(shí)驗(yàn)證明太赫茲成像能夠區(qū)分生物組織中的水分分布,有望于應(yīng)用于腫瘤診斷成像[58-60].

在上述系列研究中,研究者主要從以下角度解釋太赫茲波識別腫瘤的內(nèi)在機(jī)理.1) 含水量差異:基于太赫茲波水敏感性特征,由于腫瘤代謝旺盛、生長迅速且具有較強(qiáng)的免疫原性,腫瘤區(qū)域往往伴有大量的血管生成和炎癥反應(yīng),使得腫瘤區(qū)域的含水量較高,水的折射率和吸收系數(shù)高于正常組織,可據(jù)此區(qū)分腫瘤與正常組織[92-94];2) 宏觀結(jié)構(gòu)差異[95]: 低級別的腫瘤新生毛細(xì)血管較少、代謝相對較慢,局部呈現(xiàn)相對較低的血流灌注狀態(tài);而高級別腫瘤新生血管較為豐富,且生長速度較快,易發(fā)生組織壞死與囊變,呈現(xiàn)不均勻灌注,太赫茲技術(shù)可以反映組織微循環(huán)狀態(tài),據(jù)此進(jìn)一步區(qū)分不同惡性程度腫瘤;3) 介觀尺度差異: 癌細(xì)胞侵襲性生長,腫瘤區(qū)域的細(xì)胞核數(shù)量大于正常區(qū)域,從而導(dǎo)致更多的細(xì)胞,其細(xì)胞密度、結(jié)構(gòu)以及對應(yīng)生物大分子含量與正常組織差異明顯[95];4) 微觀結(jié)構(gòu)差異: 即分子構(gòu)成差異,從物理表征來看,太赫茲波對腫瘤的表征,實(shí)際上是對其內(nèi)所含生物分子(主要是蛋白)集體振動、轉(zhuǎn)動模式差異的檢測,太赫茲波對腫瘤特征分子蛋白構(gòu)象、蛋白與蛋白相互作用及突變等敏感,證明了利用太赫茲光譜診斷腫瘤的可行性[96].

3.3 太赫茲光譜和成像技術(shù)在膠質(zhì)瘤診斷中的應(yīng)用

研究者為了探索太赫茲技術(shù)在膠質(zhì)瘤診斷中的應(yīng)用價(jià)值,大多數(shù)都是采用太赫茲光譜及成像技術(shù)對膠質(zhì)瘤組織進(jìn)行檢測.隨著研究的進(jìn)一步深入,也出現(xiàn)了利用太赫茲技術(shù)檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞和膠質(zhì)瘤特征性分子的研究,進(jìn)一步拓展了太赫茲技術(shù)的應(yīng)用范圍.我們總結(jié)了太赫茲技術(shù)在膠質(zhì)瘤不同物理尺度樣本檢測中的研究現(xiàn)狀,主要包括組織、細(xì)胞和特征性分子的檢測研究,圖4 展示了近10 年來太赫茲技術(shù)在膠質(zhì)瘤診斷研究領(lǐng)域的發(fā)文情況(圖4).當(dāng)前基于太赫茲技術(shù)研究膠質(zhì)瘤的結(jié)果如表3 所示.

表3 當(dāng)前基于太赫茲技術(shù)研究膠質(zhì)瘤的結(jié)果Table 3. Current results of glioma studies using the terahertz techniques.

圖4 近10 年太赫茲技術(shù)在膠質(zhì)瘤診斷研究中的發(fā)文情況Fig.4.Publication of THz technology in glioma diagnosis in recent 10 years.

3.3.1 膠質(zhì)瘤組織的太赫茲檢測

太赫茲技術(shù)作為一種“圖譜合一”的檢測方法,可在獲取樣本光譜信號的同時進(jìn)行成像研究.典型的太赫茲成像系統(tǒng)產(chǎn)生的輻射波長范圍為30 μm—3 mm,所以太赫茲波不太容易在生物組織內(nèi)散射,且太赫茲波具有水敏感性,而膠質(zhì)瘤組織比周圍組織水濃度高,所以太赫茲技術(shù)在膠質(zhì)瘤診斷方面具有良好的前景.2011 年,韓國延世大學(xué)Oh 等[62]首次將太赫茲技術(shù)應(yīng)用于膠質(zhì)瘤組織的檢測研究,他們采用反射式太赫茲脈沖成像系統(tǒng)(THz pulsed imaging,TPI)研究了新鮮離體大鼠腦膠質(zhì)瘤模型.結(jié)果顯示太赫茲波成像顯示的腫瘤區(qū)域與核磁檢測區(qū)域相吻合.進(jìn)一步,他們發(fā)現(xiàn)大鼠腦灰質(zhì)和白質(zhì)的太赫茲反射參數(shù)存在差異,并推測這可能源于灰質(zhì)中髓鞘的含量較低.這項(xiàng)研究初步證明了太赫茲波對腦膠質(zhì)瘤識別的潛力,為后續(xù)腦膠質(zhì)瘤檢測研究奠定了基礎(chǔ).為了進(jìn)一步解釋太赫茲波生物組織成像機(jī)制,2014 年,Oh 等[69]再次利用TPI 技術(shù)進(jìn)行腦膠質(zhì)瘤組織識別研究,結(jié)果驗(yàn)證了太赫茲波技術(shù)可實(shí)現(xiàn)新鮮離體腦組織腫瘤邊界的清晰劃分,且可識別腦組織中的灰質(zhì)和白質(zhì)區(qū)域.另外,他們還實(shí)現(xiàn)了石蠟包埋腦組織中腫瘤區(qū)域的識別,通過與HE 染色結(jié)果對比,推測TPI 技術(shù)識別腫瘤主要源于該區(qū)域的高密度細(xì)胞.同年,Meng 等[42]利用太赫茲時域光譜系統(tǒng)檢測石蠟包埋腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織.結(jié)果顯示,與正常組織相比,石蠟包埋腦膠質(zhì)瘤具有更高的折射率、吸收系數(shù)和介電常數(shù);進(jìn)一步分析了石蠟包埋腦膠質(zhì)瘤成像的最佳太赫茲參數(shù).

以往基于太赫茲技術(shù)進(jìn)行的腦膠質(zhì)瘤研究證明正常和腫瘤組織的差異主要來源于含水量和細(xì)胞密度的差異,但是尚未進(jìn)行定量的解釋.為了回答這一問題,2016 年,Yamaguchi 等[53]獲得了新鮮和石蠟大鼠腦組織的太赫茲波反射率光譜.通過定量分析,計(jì)算得出新鮮腦膠質(zhì)瘤組織中的含水量比正常組織增加了大約5%,腦膠質(zhì)瘤組織單位面積的細(xì)胞核密度比正常組織增加15%以上,這兩者的共同作用導(dǎo)致腫瘤區(qū)域的折射率高于正常組織.基于此結(jié)果,Yamaguchi 等[78]嘗試采用復(fù)折射率獲得鼠腦太赫茲圖像,探索使用太赫茲波檢測腦腫瘤的內(nèi)在機(jī)理.結(jié)果顯示,利用太赫茲檢測區(qū)域的復(fù)折射率結(jié)合主成分分析,可進(jìn)行新鮮離體大鼠腦組織的腫瘤區(qū)域可視化.他們發(fā)現(xiàn)太赫茲成像中顯示的腫瘤區(qū)域大于染色圖像中,這主要與腫瘤病灶周圍存在的水腫區(qū)域有關(guān).通常,為了改善缺氧和營養(yǎng)物質(zhì)的微環(huán)境,腫瘤組織的新生血管增加,進(jìn)一步導(dǎo)致了該區(qū)域含水量增大.另外,細(xì)胞代謝的病理變化也將導(dǎo)致腫瘤區(qū)域周圍出現(xiàn)水腫,此變化僅影響水腫組織區(qū)域的含水量,對細(xì)胞密度沒有影響.Kucheryavenko 等[91]研究了腦組織區(qū)域結(jié)構(gòu)及膠質(zhì)瘤異質(zhì)特性的太赫茲光學(xué)特性.發(fā)現(xiàn)正常組織和腫瘤組織間存在差異,且腦組織中有異質(zhì)特征,這可能源于白質(zhì)和灰質(zhì)的不同反應(yīng)、不同神經(jīng)血管結(jié)構(gòu)的存在以及壞死碎片和出血等.在術(shù)中診斷過程中,這種異質(zhì)性可能會導(dǎo)致神經(jīng)腫瘤邊緣描繪的復(fù)雜化.

為了分析太赫茲技術(shù)在術(shù)中神經(jīng)診斷方面的潛在價(jià)值,韓國延世大學(xué)Ji 等[79]在2016 年嘗試進(jìn)行原位移植瘤及不同級別(WHO 2—4 級)離體人腦膠質(zhì)瘤組織的太赫茲成像研究.結(jié)果表明,太赫茲波識別腫瘤區(qū)域與組織病理顯示區(qū)域基本吻合,證實(shí)了太赫茲技術(shù)可用于神經(jīng)腫瘤宏觀區(qū)域識別和邊界檢測,且可有效地解決組織移位和標(biāo)記等問題.隨后,Gavdush 等[87]采用太赫茲脈沖光譜技術(shù)研究了26 例不同WHO 級別明膠包埋的人腦膠質(zhì)瘤組織的太赫茲光學(xué)特征,結(jié)果顯示,不同病理級別組織間與瘤旁組織的太赫茲波折射率和吸收系數(shù)等參數(shù)具有顯著差異,且瘤周水腫區(qū)域與腫瘤具有類似的太赫茲響應(yīng).這客觀地揭示了太赫茲技術(shù)在不同WHO 級別人腦膠質(zhì)瘤手術(shù)診斷中的優(yōu)勢.基于太赫茲波腫瘤診斷的迅速發(fā)展,太赫茲波與腫瘤組織相互作用的物理模型也逐漸得到關(guān)注.基于此,Gavdush 等[90]用雙德拜(double Debye,DD)模型和雙過阻尼振子(double overdamped oscillator,DO)分析不同分級膠質(zhì)瘤組織和瘤旁的太赫茲介電響應(yīng)常數(shù).這兩個模型均可以準(zhǔn)確地再現(xiàn)太赫茲范圍內(nèi)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤響應(yīng),證實(shí)DD 模型和DO 模型可被用于參數(shù)化腦組織在太赫茲頻率下介電響應(yīng)分析.2019 年,Wu 等[58]基于反射式連續(xù)太赫茲波成像系統(tǒng),研究了新鮮離體和在體小鼠腦膠質(zhì)瘤模型.結(jié)果顯示,采用頻率為2.52 THz的太赫茲波反射成像系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)在體和新鮮離體腦組織的腫瘤區(qū)域識別,且太赫茲波成像與磁共振、HE 圖像中顯示的腫瘤區(qū)域具有良好的相關(guān)性;通過太赫茲時域光譜儀檢測發(fā)現(xiàn),在0.6—2.8 THz范圍內(nèi),腦膠質(zhì)瘤與正常腦組織的太赫茲光譜差異較大,其中腦膠質(zhì)瘤的折射率和吸收系數(shù)較正常組織高,且在高頻范圍內(nèi)差異較大.這些結(jié)果表明,太赫茲成像技術(shù)作為術(shù)中無標(biāo)記診斷腦膠質(zhì)瘤的替代方法具有巨大的潛力.并且解釋了小鼠正常和腫瘤腦組織的區(qū)別在于腫瘤組織中水分含量的增加,主要是由于新血管、壞死碎片的體液和細(xì)胞密度變化引起的.證實(shí)了單點(diǎn)掃描太赫茲成像技術(shù)可通過檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞特征識別腫瘤邊界,為臨床應(yīng)用檢測腦膠質(zhì)瘤疾病提供了一種新的腫瘤檢測方法.為了提高太赫茲波在膠質(zhì)瘤成像中的分辨率,Wu等[59]在2020 年報(bào)道了水平掃描連續(xù)波太赫茲ATR成像系統(tǒng).通過優(yōu)化ATR 棱鏡,使得成像面積達(dá)到與棱鏡成像面一樣大,其不僅可避免二次反射的影響,且系統(tǒng)在水平和垂直方向上的成像分辨率可分別達(dá)400 μm 和450 μm.通過采用高折射率材料的全反射棱鏡和較大的太赫茲波入射角,有助于更小尺寸腫瘤組織的識別.此外,通過該成像系統(tǒng)可以清晰區(qū)分大小不同的膠質(zhì)瘤區(qū)域.且太赫茲圖像顯示的腫瘤區(qū)域的體積、位置與肉眼及HE 染色圖像的宏觀顯示相似.同年,該團(tuán)隊(duì)Wang 等[89]針對連續(xù)波太赫茲圖像提出了一種混合ROI 分割方法.該方法結(jié)合了塊匹配3D 去噪、模糊c-means聚類、形態(tài)學(xué)操作和canny 邊緣檢測,實(shí)現(xiàn)連續(xù)太赫茲圖像的ROI 高效識別.結(jié)果顯示使用這種混合ROI 分割方法能夠精確分割腫瘤區(qū)域,準(zhǔn)確度、靈敏度和特異性分別為95.6%,84.5% 和97.7%.

3.3.2 膠質(zhì)瘤細(xì)胞的太赫茲波檢測

與膠質(zhì)瘤組織波譜成像研究相比,太赫茲技術(shù)檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞研究起步較晚.2019 年,Wang 等[97]對膠質(zhì)瘤細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行了太赫茲光譜檢測,提出了一種在細(xì)胞厚度未知情況下,結(jié)合單層和雙層ATR 模型來確定活細(xì)胞介電響應(yīng)的方法.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,太赫茲介電響應(yīng)特性與細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞內(nèi)液體和細(xì)胞結(jié)構(gòu)顯著相關(guān).此外,膠質(zhì)瘤細(xì)胞(C6 和U87)與正常膠質(zhì)細(xì)胞相比具有不同的介電特性,這可能是太赫茲波識別膠質(zhì)瘤組織的原因之一.隨著膠質(zhì)瘤分子分型的提出,Zhang 等[98]提出了由切割線和裂環(huán)諧振器組成的超材料生物傳感器,在生物傳感器表面培養(yǎng)了兩種類型的膠質(zhì)瘤細(xì)胞(IDH 突變型和野生型).測量結(jié)果表明,在沒有抗體引入的情況下,通過觀察任何細(xì)胞濃度下EIT 共振頻率和幅度的變化,可以直接區(qū)分突變型和野生型膠質(zhì)瘤細(xì)胞.這為太赫茲波識別膠質(zhì)瘤分子分型開辟了新途徑.

3.3.3 膠質(zhì)瘤特征性分子的太赫茲波檢測

除此之外,研究者還對膠質(zhì)瘤特征性分子等進(jìn)行了檢測.γ-氨基丁酸(GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),其構(gòu)象對選擇生物功能和信號傳遞過程至關(guān)重要.雖然這種神經(jīng)活性分子已經(jīng)被廣泛研究,但是其在太赫茲波段的構(gòu)象和分子間相互作用有關(guān)的振動特性尚未在實(shí)驗(yàn)中確定.Cheng 等[99]應(yīng)用0.5—18.0 THz 的寬帶THz-TDS系統(tǒng)來表征GABA 獨(dú)特的指紋信息.研究結(jié)果表明,GABA 在1.15 和1.39 THz 有明顯的集體振動.太赫茲波高頻下的吸收攜帶部分集體振動,但更多地反映了特定的局部振動信息,包括骨架變形和官能團(tuán)的搖擺,這些與GABA 的構(gòu)象和靈活性密切相關(guān).這項(xiàng)研究可能有助于理解神經(jīng)遞質(zhì)分子的構(gòu)象轉(zhuǎn)變和與太赫茲波的共振反應(yīng).L-谷氨酸(L-Glu)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中迅速積累,然后轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺[100].Ruggiero 等[101]測量了左旋谷氨酸的多晶型.結(jié)果表明,太赫茲光譜可以區(qū)分左旋谷氨酸構(gòu)象形式.IDH1 突變在膠質(zhì)瘤中很常見,可產(chǎn)生s2-羥基戊二酸二鈉鹽(2-hydroxyglutarate,2HG),其作為膠質(zhì)瘤的標(biāo)志物,可用于研究腫瘤的發(fā)展階段,以及識別正常組織與癌組織的邊界.盡管磁共振波譜法(magnetic resonance spectroscopy,MRS)可對2HG 進(jìn)行有效地檢測,但是檢測時間至少為20 min,且2HG(連續(xù)合成和分解)存在變異性,將導(dǎo)致2HG 的圖像檢測結(jié)果無法作為醫(yī)療外科診斷時的實(shí)時圖像.Chen 等[94]利用太赫茲時域光譜系統(tǒng)研究了2HG 同分異構(gòu)體的振動光譜,并利用密度泛函理論進(jìn)一步區(qū)分了它們的物理性質(zhì).研究發(fā)現(xiàn)同分異構(gòu)體L-2HGDS 和D-2HGDS 具有不同的特征吸收峰(L-2HGDS: 0.769,1.337,1.456 和1.933 THz;D-2HGDS: 0.760,1.200,1.695 和2.217 THz).但是2-HG 和2HGDS 還是有區(qū)別的,酸基在二鈉鹽狀態(tài)下可能有不同的振動模式.異構(gòu)體之間的差異主要?dú)w因于碳鏈內(nèi)的質(zhì)子轉(zhuǎn)移.這些結(jié)果表明,太赫茲技術(shù)能夠準(zhǔn)確、快速地識別2HG 的異構(gòu)體,對膠質(zhì)瘤的進(jìn)一步研究和臨床手術(shù)具有重要意義.表皮生長因子受體 (epidermal growth factor receptor,EGFR)在膠質(zhì)瘤增殖中起重要作用,膠質(zhì)瘤組織中EGFR 的表達(dá)水平可為診斷和預(yù)后提供依據(jù).改進(jìn)EGFR 檢測技術(shù),實(shí)現(xiàn)更高的靈敏度和更快的速度,將有利于多種腫瘤的診斷.Liu 等[102]2021 年嘗試基于太赫茲技術(shù)結(jié)合金納米粒子(gold nanoparticles,GNPs)和EGFR 抗體修飾,實(shí)現(xiàn)了對EGFR 的增敏.該超材料生物傳感器還可以實(shí)現(xiàn)微小體積的EGFR 溶液檢測.因此,該技術(shù)可能應(yīng)用于實(shí)現(xiàn)EGFR 相關(guān)腫瘤的快速準(zhǔn)確檢測.

除此之外,研究者還先后對NAA、肌醇、肌酸等進(jìn)行了檢測.腫瘤引起的神經(jīng)元丟失導(dǎo)致NAA濃度降低[103].且NAA 在1.466,1.695,1.979 和2.879 THz 處發(fā)現(xiàn)了4 個特征峰.肌醇/肌酸在星形膠質(zhì)細(xì)胞病相關(guān)的腦疾病具有顯著差異[104]: 例如,高級別間變性星形細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中,肌醇/肌酸比值較低,具體為(0.39±0.11),(0.025±0.06);反之,低級別星形細(xì)胞瘤患者的肌醇/肌酸較高,數(shù)值為(2.14±1.4)[105].Yang 等[106]測量了肌醇的太赫茲光譜,發(fā)現(xiàn)在1.00,1.46,1.58,1.85 和2.05 THz有五個特征峰.King 等[107]測量了肌酸的太赫茲光譜,發(fā)現(xiàn)在1.23 和1.97 THz 有兩個特征峰.

十年間,基于太赫茲技術(shù)的腦膠質(zhì)瘤研究不斷涌現(xiàn),主要包括: 1) 從正常與病灶組織鑒別,到不同惡性程度組織的識別;2) 從離體樣品檢測,到動物在體樣本檢測;3) 膠質(zhì)瘤細(xì)胞自身具有的或外來添加的特征性分子識別.這三方面的研究為太赫茲波腫瘤檢測的應(yīng)用發(fā)展奠定了基礎(chǔ),但是從檢測機(jī)制、結(jié)果一致性、生物對照單一及臨床價(jià)值等方面,太赫茲技術(shù)仍然難以達(dá)到輔助手術(shù)醫(yī)師或病理醫(yī)師進(jìn)行診斷的效果,更鮮有關(guān)于參考分子病理學(xué)知識進(jìn)行腦膠質(zhì)瘤研究的報(bào)道.

不同的膠質(zhì)瘤分子分型,意味著各型腫瘤細(xì)胞具有截然不同分子生物學(xué)特征,由于它們蛋白表達(dá)的差異性,從而發(fā)生不一樣的生化反應(yīng)過程、顯現(xiàn)不同的疾病進(jìn)展或復(fù)發(fā)特性、對同一治療手段產(chǎn)生不同的響應(yīng)模式,最終產(chǎn)生了截然不同的治療方法.聚類具有“近似分子特征”的腫瘤細(xì)胞亞群,這些細(xì)胞亞群,才最有可能產(chǎn)生較為穩(wěn)定的太赫茲波物理表征結(jié)果,從而實(shí)現(xiàn)膠質(zhì)瘤合理精細(xì)的分子分型.

從物理表征原理上看,包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的腫瘤細(xì)胞,其尺寸一般介于亞微米到數(shù)個微米之間,在太赫茲光譜中一般不會表現(xiàn)出特征光譜結(jié)構(gòu).由多種細(xì)胞及其間質(zhì)構(gòu)成的腫瘤組織,更難以在太赫茲波譜中出現(xiàn)“吸收峰”等典型特征.太赫茲波對腫瘤的表征,實(shí)質(zhì)上是對其內(nèi)所含生物分子(主要是蛋白)集體振動、轉(zhuǎn)動模式差異的檢測.如果一類腫瘤細(xì)胞或者組織,具有某種相對穩(wěn)定的“特異性分子集合”,那么,這類腫瘤就有可能被太赫茲技術(shù)檢測出來.因此,我們提出不同分子分型腫瘤組織可能在太赫茲波段具有不同“特異性蛋白組成”的太赫茲腫瘤亞型識別機(jī)制假說.

在我國太赫茲波膠質(zhì)瘤研究進(jìn)展中,最早由天津大學(xué)姚建銓院士團(tuán)隊(duì)發(fā)起,帶動了多家研究機(jī)構(gòu)的跨學(xué)科團(tuán)隊(duì)參與研究,該研究團(tuán)隊(duì)的膠質(zhì)瘤系列研究是目前國際上最為豐富和前沿的[58-60,89,97].2021 年初,上海理工大學(xué)專家和俄羅斯科學(xué)院聯(lián)合發(fā)表了針對膠質(zhì)瘤分子標(biāo)記物進(jìn)行膠質(zhì)瘤檢測的研究綜述,總結(jié)和展望了針對膠質(zhì)瘤內(nèi)分子標(biāo)記物進(jìn)行特異性識別的太赫茲波譜識別方法,這代表了研究膠質(zhì)瘤病理分類的一個實(shí)用策略[108].近年來,常超研究員領(lǐng)導(dǎo)的跨學(xué)科研究團(tuán)隊(duì)不斷推進(jìn)太赫茲生物學(xué)領(lǐng)域研究深度[99,109-114],其創(chuàng)新研究成果對腫瘤診斷領(lǐng)域也具有重要理論啟發(fā)和技術(shù)借鑒價(jià)值.

4 太赫茲技術(shù)在膠質(zhì)瘤診斷應(yīng)用模式展望

基于上述研究進(jìn)展可知,研究人員利用太赫茲波譜差異性可初步實(shí)現(xiàn)膠質(zhì)瘤組織、細(xì)胞、特征性分子等樣本的識別.為促進(jìn)太赫茲診斷技術(shù)的臨床應(yīng)用,推進(jìn)臨床診療技術(shù)水平的提高,結(jié)合太赫茲技術(shù)特點(diǎn),進(jìn)一步提出太赫茲技術(shù)在膠質(zhì)瘤整個診療過程中的潛在應(yīng)用方式.

4.1 太赫茲技術(shù)在膠質(zhì)瘤術(shù)前診治中的應(yīng)用

快速準(zhǔn)確地檢測體液(血液及腦脊液等)中分離的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell,CTCs)、細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)、分子標(biāo)志物、代謝物、循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)和微小RNA(microRNAs,miRNA)等遺傳腫瘤材料[115-118],可實(shí)現(xiàn)膠質(zhì)瘤早期病理診斷.Kumar 等[119]提出了一種高靈敏度、低約束損耗的SC-PCF 傳感器,可基于太赫茲技術(shù)高效檢測血細(xì)胞.CTCs 是腫瘤細(xì)胞從原發(fā)性腫瘤中脫散并進(jìn)入人外周血循環(huán),可用于診斷癌癥和監(jiān)測癌癥的狀態(tài)[120,121].目前通過FDA 認(rèn)證的CTCs 檢測方法為細(xì)胞搜索系統(tǒng).但該方法的陽性率低,而且現(xiàn)有的所有CTCs 檢測方法都無法判定檢測到的細(xì)胞是存活還是凋亡的,而只有功能細(xì)胞才能夠促成轉(zhuǎn)移灶的形成.Zhu 等[122]提出了三維超材料設(shè)計(jì)將其集成到微流體芯片中,利用這種相似性與具有物理結(jié)構(gòu)的紅細(xì)胞(red blood cell,RBC)分離CTC,并用太赫茲光譜檢測CTCs,實(shí)現(xiàn)了CSCs 的分離和鑒定.腫瘤細(xì)胞釋放也會釋放ctDNA,miRNA等到體液中,并在體液中表達(dá)穩(wěn)定.目前這兩種遺傳資料主要基于PCR 技術(shù)進(jìn)行跟蹤腫瘤突變模式的變化[116,118,123].楊柯等[124]構(gòu)建并優(yōu)化了一種集成超材料技術(shù)、納米材料技術(shù)和SDA 技術(shù)的太赫茲超材料納米芯片,獲取了其檢測microRNA-21的靈敏度、特異性和重復(fù)性等一系列重要方法學(xué)指標(biāo)并進(jìn)行了臨床樣本檢測.除了體液中的分離物,體液中一些蛋白質(zhì)同樣也參與了膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展,可作為膠質(zhì)瘤的診斷指標(biāo)之一[115,125-129].在這些蛋白質(zhì)中,最具代表性的是血管內(nèi)皮生長因子和血管生成相關(guān)蛋白(FGF-B,IGFBP-2,EGF),細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(TSP12,TNC,Cyr61,CCN1,OPN等),基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2,MMP-9,AEG-1),膠質(zhì)纖維酸性蛋白,巨噬細(xì)胞遷移抑制因子和功能相關(guān)的蛋白質(zhì)(DD-T,CD74,CD44,CXCR2,CXCR4)[130,131]、髓鞘堿性蛋白(MBP)[132]等,均為腦脊液或膠質(zhì)瘤的血液生物標(biāo)志物.目前,膠質(zhì)瘤體液蛋白的檢測手段主要為質(zhì)譜等,曹燦等[133]基于太赫茲光譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)構(gòu)象識別及分子間的相互作用,研究發(fā)現(xiàn)太赫茲波可識別體液中的標(biāo)志蛋白物.代謝產(chǎn)物譜與腫瘤中特定代謝途徑的激活密切相關(guān),目前膠質(zhì)瘤血漿樣品篩選出224 種代謝產(chǎn)物[134],特別在高級別和低級別膠質(zhì)瘤,有五種代謝物(尿嘧啶、精氨酸、乳酸、胱胺酸和鳥氨酸)具有顯著差異,而且已經(jīng)觀察到與核苷酸(例如,嘧啶),氨基酸(例如,精氨酸、谷胱甘肽、丙氨酸)和碳水化合物(例如,糖酵解和丙酮酸)代謝有關(guān)途徑的顯著變化,這與腫瘤的特征發(fā)展一致[135].另外,燕芳等[136]通過對氨基酸官能團(tuán)太赫茲振動模式研究,為太赫茲代謝物的診斷提供了可能.

除此之外,神經(jīng)膠質(zhì)瘤可通過細(xì)胞外囊泡、外泌體等與鄰近細(xì)胞進(jìn)行信息交流,幾乎可以從所有體液中提取[116,137-140].據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤EVs中MicroRNA-301a[141-143],核酸變化[144],miRNA-21[145],miRNA-1587[146]和Epha2[147]等顯著增加.太赫茲波可通過檢測EVS 中物質(zhì)成分進(jìn)行膠質(zhì)瘤診斷.然而由于水敏感問題的存在,既往研究多局限在固相或干燥狀態(tài)下分子、細(xì)胞、組織等,為了降低水溶液對太赫茲波的強(qiáng)烈吸收,增強(qiáng)太赫茲信號,提高檢測的精度和靈敏度,因此可針對液相環(huán)境的傳感器芯片方向設(shè)計(jì),或者采用分子動力學(xué)等構(gòu)建生物分子溶液檢測模型[148].Zhang 等[149]設(shè)計(jì)了一種新型的微流體多通道超材料生物傳感器(multi-microfluidic-channel metamaterial biosensor,MMCMMB).多通道主要設(shè)置在超材料強(qiáng)電場增強(qiáng)區(qū)域,大大減少了液量,增強(qiáng)了傳感目標(biāo)與太赫茲波的相互作用,從而提高了靈敏度.通過異丙醇-水混合物和牛血清白蛋白溶液的傳感結(jié)果證明了該設(shè)計(jì)的有效性和在THz 生物傳感方面的巨大潛力.此設(shè)計(jì)具有靈敏度高、無標(biāo)簽、成本低、操作方便、液體量的優(yōu)點(diǎn),可為液體基物質(zhì)的太赫茲無標(biāo)記生物傳感提供了一條可靠的途徑[149].Zhou等[150]通過太赫茲石墨烯-超表面微流控平臺增強(qiáng)生物分子與太赫茲波的相互作用,從而提高靈敏度.為了驗(yàn)證這一概念,采用了純微流控單元、超表面微流控單元和石墨烯微流控單元進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn),探索并驗(yàn)證了微流控單元的傳感機(jī)理.證明了基于石墨烯-超表面THz 雜化微流控器件的精密傳感的高靈敏度[149].此外,研究者也采用分子動力學(xué)實(shí)現(xiàn)水溶液樣品檢測.例如: Sebastiani 等[151]基于對甘氨酸等氨基酸溶液進(jìn)行THz 測量,通過abinitio 分子動力學(xué)模擬證實(shí)在315 cm 處的N-C-CO 開/關(guān)模式可作為敏感的、無標(biāo)記的酰胺基局部質(zhì)子化探針.實(shí)驗(yàn)證實(shí)了,由于質(zhì)子化引起的強(qiáng)度變化可以通過THz 時域(0—50 cm)和精確的THzft 光譜(50—400 cm)探測到,實(shí)現(xiàn)了太赫茲光譜在無標(biāo)記方式下探測天然氨基酸在水中的電荷狀態(tài)[151].

4.2 太赫茲波譜與成像技術(shù)在膠質(zhì)瘤手術(shù)中的應(yīng)用前景

除了術(shù)前的體液診斷,太赫茲波技術(shù)對于術(shù)中組織、細(xì)胞的診斷研究也是可靠的.術(shù)中實(shí)現(xiàn)膠質(zhì)瘤邊界從不可見變?yōu)榭梢?以及快速實(shí)時獲得腫瘤分子分型信息,有效指導(dǎo)術(shù)中腫瘤切除.

與正常細(xì)胞相比,癌細(xì)胞中有更多的自由水和較少的結(jié)合水.更重要的是,細(xì)胞水化程度隨著癌細(xì)胞的惡性程度而增加,表明細(xì)胞內(nèi)水合可能是致癌物中的主要因素,例如,增加水化可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的呼吸,一定程度上可以增強(qiáng)用于使用營養(yǎng)素的癌細(xì)胞的競爭優(yōu)勢.Zhang 等[152]提供了一種非免疫生物傳感技術(shù),即基于太赫茲范圍內(nèi)各向異性共振分裂環(huán)諧振器的等離子體生物傳感器成功地實(shí)現(xiàn)了癌細(xì)胞的無抗體識別,證明了太赫茲光譜檢測腫瘤細(xì)胞的可能性.組織的定位及定性對于膠質(zhì)瘤術(shù)中的精準(zhǔn)切除同樣至關(guān)重要.太赫茲技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)膠質(zhì)瘤術(shù)中定位,克服膠質(zhì)瘤組織移位、無標(biāo)記等,從而有效地區(qū)分腫瘤邊緣及腦組織成分[42,58,59].太赫茲技術(shù)實(shí)現(xiàn)膠質(zhì)瘤定性,可根據(jù)分子分型結(jié)果決定手術(shù)切除程度,從而指導(dǎo)手術(shù)策略的制定.盡管如此,由于太赫茲光譜成像系統(tǒng)的高成本和人體工程學(xué)低,臨床實(shí)踐目前還很遙遠(yuǎn).另外,考慮到太赫茲光學(xué)的功能材料和器件,將太赫茲反射或光譜學(xué)集成到傳統(tǒng)的神經(jīng)外科工作流程和神經(jīng)探針中非常具有挑戰(zhàn)性.

4.3 太赫茲技術(shù)在膠質(zhì)瘤術(shù)后病理診斷及預(yù)后監(jiān)測中的應(yīng)用前景

病理信息進(jìn)一步明確有助于患者治療方案制定.目前已證實(shí)膠質(zhì)瘤組織新鮮切片及石蠟切片的太赫茲波譜成像[42].然而輔助組織學(xué)的太赫茲波檢測技術(shù)需要優(yōu)化組織固定程序,目前已經(jīng)考慮了在太赫茲光譜范圍內(nèi)使用的多種固定組織的方法,其中包括福爾馬林[153]、明膠[154],及各種浸漬劑的組織脫水,以使太赫茲波穿透組織的深度增加,并突出正常和病理組織的非水因素的相關(guān)差異[155-157].石蠟包埋[7,42,158],組織凍結(jié)等可以增加組織探測深度并揭示組織的非水相關(guān)特征,包括癌癥DNA 中的準(zhǔn)共振反應(yīng)DNA 甲基化[50,159].除此之外,術(shù)后監(jiān)測對于膠質(zhì)瘤診療和預(yù)后同樣重要,術(shù)后監(jiān)測主要是體液檢測,基于4.1 節(jié)的描述,太赫茲技術(shù)也有望實(shí)現(xiàn)膠質(zhì)瘤術(shù)后定期監(jiān)測.

圖5 給出了THz 技術(shù)在臨床膠質(zhì)瘤診斷方面的新模式.總之,太赫茲因其獨(dú)特性質(zhì)在腫瘤診斷方面取得了很多前瞻性的進(jìn)展,并且在膠質(zhì)瘤整個診療過程中具有潛在應(yīng)用價(jià)值,有望實(shí)現(xiàn)“定位同時定性”的外科目標(biāo).

圖5 THz 技術(shù)在臨床膠質(zhì)瘤診斷方面的新模式Fig.5.New models of THz technology in clinical glioma diagnosis.