基于外泌體中基因序列構建miRNA-mRNA預測復治肺結核特異的關鍵基因

徐振華，李奇鳳，王 泉

1.北京兒童醫院新疆醫院/新疆維吾爾自治區兒童醫院/新疆兒科研究所，新疆烏魯木齊 830054；2.新疆醫科大學第八附屬醫院檢驗科，新疆烏魯木齊 830049

外泌體是從體內細胞釋放的直徑為40～160 nm源于內吞體的囊泡，包括蛋白質、脂質、mRNA及非編碼RNA和DNA等。外泌體可以將其內含物(尤其是miRNA)釋放到鄰近和遠端細胞中，參與體內很多生物反應，如細胞與細胞之間信號通信，基因轉錄和翻譯的調控，免疫反應平衡和中樞、外周免疫調節，受體配體信號，細胞分化和腫瘤，宿主-微生物群的相互作用和病毒免疫等。然而，本文通過對初治肺結核(ATB)和復治肺結核(RTB)外泌體進行富集提取、建庫測序和生物信息分析來預測相關靶向調控，借助生物信息學構建miRNA-mRNA的關系，在分子水平上把控復治肺結核特異表達的關鍵基因，為新的藥物研發提供思路和理論支撐。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集ATB和RTB患者和健康對照者(HC)的新鮮外周血，離心后取血漿，行血漿外泌體檢測、建庫、測序，每份標本形成相應的數據庫。根據所建外周血外泌體數據庫獲取相應的差異表達miRNA和mRNA。使用R語言“edgeR”包對所建肺結核外泌體數據進行差異表達分析，以|log2FC|≥2，FDR<0.05為條件篩選差異miRNA，調用enhancedvolcano R包繪圖，使用DESeq2進行差異表達分析。

1.2外泌體RTB特異性差異表達miRNA和mRNA篩選 miRNA差異表達的數據輸入為miRNA表達水平分析中得到的readcount數據。對于有生物學重復的樣品，采用基于負二項分布的DESeq2進行分析；對于無生物學重復的樣品，DEGseq會采用TMM算法對readcount數據進行標準化處理，然后進行差異分析，篩選RTB特異性差異表達miRNA和mRNA，用韋恩圖來表示。

1.3差異表達 miRNA下游靶基因的預測 通過miRNet數據庫預測差異表達miRNA在RTB特異性下游靶基因。

1.4功能富集分析和蛋白-蛋白相互作用(PPI) 網絡 使用可視化軟件Cytoscape繪制miRNA-mRNA調控網絡圖。利用在線網站 STRING 11.0(https:// string-db.org/)構建靶基因之間相互作用，并使用Cytoscape核心插件cytohubba篩選Degree數最高的前20個靶基因進行后續分析。

2 結 果

2.1從外泌體所建數據庫中篩選出ATB和RTB差異表達miRNA共1 408個基因(如圖1A)。

2.2ATB和RTB差異表達 miRNA的韋恩圖 ATB和RTB差異表達miRNA的以log10值進行聚類，ATB的差異表達miRNA和RTB的差異表達miRNA取交集得到19個共表達差異表達miRNA，ATB中有92個獨立差異表達miRNA，RTB中有11個獨立差異表達miRNA(圖1B)。

2.3RTB特異的差異表達miRNA下游靶基因預測 通過miTarbare和miRanda數據庫共篩選出RTB特異的差異表達miRNA下游靶基因預測為375個(圖1C)。

2.4RTB特異的差異表達miRNA下游靶基因進行功能富集分析(GO)和信號通路富集分析(KEGG) 為了明確篩選出RTB特異的差異表達miRNA下游靶基因的生物學作用，使用GOSeq、topGO、hmmscan軟件對 375個RTB特異的差異表達miRNA下游靶基因進行GO和KEGG途徑富集分析。在 GO 功能注釋中，由于基因較多對GO中前10位基因進行功能注釋，生物過程分析揭示目標基因在三酰甘油生物合成和代謝過程中的正調控、腸道膽固醇吸收、膜組織等較多富集；分子功能分析目標基因在RNA聚合酶Ⅲ復合物、U2型催化步驟1剪接體、PRC1復合物、在線粒體外層的整體膜蛋白等富集；細胞成分分析表明目標基因明顯富集于雙鏈端粒DNA結合蛋白、蛋白酶結合、小GTP酶結合蛋白、端粒DNA結合蛋白等富集(圖1D)。KEGG 途徑富集分析結果顯示：目標基因在mRNA監測通路、單純皰疹病毒1型感染、非同源端連接、色氨酸代謝、脂肪消化和吸收等富集(圖1E)。

圖1 RTB特異的差異表達miRNA獲得及下游靶基因的富集過程注：A為ATB和RTB所篩選差異表達miRNA的火山圖；B為ATB和RTB差異表達miRNA的韋恩圖；C為RTB特異的差異表達miRNA下游靶基因預測；D為RTB特異的差異表達miRNA下游靶基因GO富集柱狀圖；E為RTB特異的差異表達miRNA下游靶基因KEGG富集散點圖。

2.5從外泌體所建數據庫中篩選出ATB和RTB差異表達mRNA共4 432個基因(圖 2A)。

2.6ATB和RTB差異表達mRNA的韋恩圖 ATB和RTB差異表達mRNA的以log10值進行聚類；ATB的差異表達miRNA和RTB的差異表達mRNA取交集得到94個共表達差異表達mRNA，ATB中有201個獨立差異表達mRNA，RTB中有308個獨立差異表達mRNA(圖2B)。

2.7RTB特異的差異基因mRNA的功能富集分析和信號通路富集分析 為了明確篩選出目標基因的生物學作用，使用GOSeq、topGO、hmmscan軟件對 308個RTB特異的差異表達mRNA靶基因進行 GO功能注釋和 KEGG 途徑富集分析。在 GO 功能注釋中，由于基因較多對GO中前10位基因進行功能注釋，生物過程分析揭示目標基因在蛋白質去磷酸化的負調控、對線粒體上蛋白質定位建立的正調控、中性粒細胞脫顆粒、中性粒細胞的激活涉及免疫應答等富集；分子功能分析目標基因在細胞核、細胞內膜結合細胞器、細胞-底物連接、肌動蛋白細胞骨架等富集；細胞成分分析表明目標基因明顯富集于RNA結合蛋白、單鏈端粒DNA結合蛋白、核苷—三磷酸酶活性、激酶結合等(圖2C)。KEGG 途徑富集分析結果顯示：目標基因在人類T細胞白血病病毒1型感染、細胞衰老、血小板活化、神經變性通路肌萎縮性側索硬化癥等富集(圖2D)。

2.8RTB特異的差異表達miRNA的靶基因韋恩圖 對RTB特異的差異表達mRNA與RTB特異的差異表達 miRNA 預測的靶基因進行綜合分析后取交集，共有8個靶向目標基因(圖2E)。

2.9PPI網絡的建立與分析 將所有目標基因導入 String 數據庫中，構建目標基因的PPI網絡，再將數據輸入到BLAST軟件建立一個更直觀的 PPI 網絡，并根據網絡拓撲分析得出前20個關鍵基因，包括高表達RTB特異的差異表達基因 miRNA 的靶基因：PABPC1、EEF1A1、VCP、HNRNPA1；低表達RTB特異的差異表達基因 miRNA 的靶基因：DDX17、MAPK14、FLNA、TPT1、POLR2E(圖2F)。

圖2 RTB特異差異表達mRNA獲得及富集和目標基因PPI網絡注：A為ATB和RTB差異表達mRNA加強火山圖；B為ATB和RTB差異表達mRNA的韋恩圖；C為RTB特異的差異蛋白基因mRNA的GO富集圖；D為RTB特異的差異基因mRNA的KEGG富集圖；E為RTB特異的差異表達imRNA的靶基因韋恩圖；F為RTB特異的PPI調控網絡。

3 討 論

RTB指既往不規律抗結核治療≥1個月以及初治失敗和復發的肺結核患者[1]，是耐藥肺結核傳播的重要來源。尋找RTB的病因、發病機制對解決耐藥肺結核顯得尤為重要，同時也為治療RTB提供新型的方案。本研究中通過構建外泌體基因序列中miRNA-mRNA的關系揭示RTB在分子水平上調控機制。

在耐藥情況、影像學改變和免疫功能檢查等方面，RTB和ATB患者有不同程度的區別。有研究報道，與ATB相比，RTB患者對利福平耐藥率更高[2]。曹盼等[3]報道，利福平耐藥RTB比ATB患者空洞數量多、最大內徑大。同時，空洞壁鈣化、肺實變、毀損肺等CT表現也比初治患者嚴重。ATB和RTB患者體內存在不同程度的淋巴細胞亞群改變[4]，其中T淋巴細胞亞群、NK細胞比例與肺結核患者所處不同感染階段有一定的關聯性。RTB和ATB不僅在以上情況有不同，而且在基因表達數量上不一樣。本研究通過ATB和RTB差異表達miRNA的聚類分析顯示RTB中有11個獨立差異表達miRNA，ATB中有92個獨立差異表達miRNA。進一步預測RTB特異性差異表達miRNA下游靶基因有375個，并對此基因進行GO和KEGG，富集分析揭示目標基因在三酰甘油生物合成、代謝過程中的正調控、腸道膽固醇吸收等脂質代謝改變；RNA聚合酶Ⅲ復合物、U2型催化步驟1剪接體、小GTP酶結合蛋白、端粒DNA結合蛋白、在線粒體外層的整體膜蛋白等參與基因轉錄和翻譯方面調節。有研究結果顯示，在Mtb休眠和重新激活期間，參與不同階段能量代謝的蛋白質相對數量是不同的，例如不同的酸度、滲透壓和營養缺乏等微環境[5]。結核分枝桿菌為能夠在復治和初治狀態之間切換，通過改變其代謝網絡的路線，以響應不同的感染階段。結核分枝桿菌為了其生存和在限制條件下的宿主體內保持持久性必然要表現出代謝功能的多面性。作為異養生物，Mtb能夠代謝多種碳源，這些碳源可由細菌合成或從宿主細胞獲得[6-8]。

本研究對RTB特異性差異表達miRNA下游靶基因預測并進行富集分析，結果顯示在脂質代謝和基因轉錄和翻譯等方面進行調控，說明RTB患者通過在能量代謝和基因表達等方面做出改變迎合所處環境。對目標基因mRNA的富集分析提示目標基因mRNA和差異表達miRNA預測的下游基因的富集分析互相適用、相互補充功能調控RTB發生和發展，這為以后研發治療RTB新型的抗結核藥物提供了靶點。

在本研究構建的miRNA-mRNA調控網絡模型中，得到9個顯著高低表達靶基因，可能在RTB中發揮重要的生物學作用。PABPC1參與mRNA翻譯[9-10]，高腺苷酸化[11]，無義介導的衰變[12]和替代多腺苷酸化[13]等多種體內調節。有研究報道PABPC1將hnRNPLL招募到RNA的3′末端，并通過mRNA替代多腺苷酸化調節并調節漿細胞中從mIg到sIg的轉變，證實漿細胞特異性RBP和普遍表達的RBP(PABPC1)之間的相互作用共同調節B細胞中免疫球蛋白分泌，其高表達可增強RTB中免疫球蛋白對結核分枝桿菌殺傷[14]。真核翻譯伸長因子-1α1(eEF1A1)負責核糖體蛋白合成[15]，與伴侶介導的自噬[16]和細胞凋亡[17]有關，eEF1A1與PARP1和TXK形成復合物可作為Th1細胞特異性轉錄因子，結合IFN-γ的啟動子以直接調節IFN-γ轉錄，因此其與Th1細胞因子的產生密切相關[18]。有研究提出eEF1A1與FadD13結合對于巨噬細胞中的Mtb增殖和在Mtb感染期間促炎細胞因子的產生起著關鍵作用[19]，敲低eEF1A1可消除由FadD13誘導的促炎細胞因子。DDX17是一種RNA依賴性ATP酶，與病毒感染和免疫應答密切相關[20-22]。而本研究顯示DDX17在RTB低表達，其參與RTB發生、發展的調控。眾所周知，MAPK包括MAPK1-MAPK3、JNK和p38 MAPK，均與自噬調節有關。MAPK14直接磷酸化蘇氨酸75的ATG5激活導致自噬體-溶酶體融合損傷，從而損害了自噬[23]。這和本研究相符，通過PPI網絡分析MAPK14在RTB中低表達，從而有利于自噬參與細胞穩態，發育和免疫等代謝機制，促進RTB的發生、發展。更有研究進一步證實，氧化應激在自噬抑制后介導MAPK14信號傳導和DNA損傷標志物方面可能起作用[24]。

綜上所述，通過外泌體構建miRNA-mRNA預測RTB特異性關鍵基因，這為今后探尋RTB分子機制、研發新型基因藥物提供靶點和思路，但本研究不足之處在于沒有驗證關鍵基因在RTB組織中的表達，進一步證實該基因是否存在組織中，下一步研究完善相關驗證。