碳點基分子印跡熒光探針的制備及其對磺胺甲基嘧啶的特異性識別研究

楊繼亮 陳潔肖 岳賢田

（1.巢湖學院 化學與材料工程學院，安徽 巢湖 238024；2.溫州市環境科技有限公司，浙江 溫州 325000）

0 引言

磺胺甲基嘧啶（SMR）是畜牧業和水產養殖業常用的磺胺類藥物，主要用以預防及治療細菌感染。近年來，在天然水體及二級出水中頻繁檢測出磺胺類抗生素，給環境和人類帶來了極大的健康風險[1]。磺胺類抗生素的廣泛應用使其在水中易發生富集現象，環境中微生物無法完全將其分解，從而逐漸誘發產生耐藥性，致使藥物生命周期縮短[2-4]。抗生素耐藥性的全球性蔓延已成為社會關注的重大問題。

傳統的抗生素檢測方法包括高效液相色譜法、高效液相色譜串聯質譜法、酶聯免疫吸附法以及氣相-質譜聯用法等。這些方法普遍存在設備昂貴、成本高、操作復雜且基層檢測部門難以普及等缺點。因此，研究建立一種快速簡便準確的檢測方法對于保障環境安全與人體健康具有重要的意義。熒光生物傳感器由于其操作簡單、檢測靈敏度高、響應迅速、耗時短、成本較低等優點成為研究的熱點。傳統的熒光生物傳感器存在識別能力不強的問題，分子印跡技術為解決這個問題提供了新的方法[5]。分子印跡技術（MIT）是一種通過具有特定空穴結構與功能位點聚合物來實現特異性識別的技術，將分子印跡技術與熒光生物傳感器結合制備分子印跡熒光傳感器受到廣泛的關注。邵可滿等[6]利用稀土配合物分子印跡熒光探針快速檢測水中孔雀石綠含量，其檢測線性范圍達 0～20 μmol·L-1，并成功應用于魚肉中孔雀石綠的檢測。吳長春等[7]以摻氮碳量子點為熒光響應信號構建磺胺嘧啶比率熒光探針，對0～100 μmol·L-1的SDZ溶液具有較好的檢測效果。宋敏霞等[8]制備CsPbBr3量子點分子印跡熒光探針實現了膽固醇的檢測。目前，分子印跡熒光傳感器所采用的熒光源多為半導體量子點[9-10]，對環境造成一定壓力。碳量子點作為新型零維納米碳材料，具有低毒性、良好的生物相容性、穩定性、耐光漂白性等優點，是制備環境友好型分子印跡熒光傳感器極具發展潛力的熒光源材料。

分別以摻氮碳量子點、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、乙二醇二甲基丙烯酸酯和磺胺甲基嘧啶分別作為熒光源、功能單體、交聯劑和模板分子，制備了具有特異性識別能力的碳點基分子印跡熒光傳感器（CQDs-MIP）。基于模板分子與特異性位點結合后發生電荷轉移導致熒光猝滅的機理，建立了快速、高選擇性且可視化檢測水環境中磺胺甲基嘧啶的新方法。

1 實驗部分

1.1 CQDs的制備

前期已完成碳量子點的制備研究工作，制備方法如文獻[11]所示。具體步驟如下：取1 g無水檸檬酸和0.7 g三羥甲基氨基甲烷溶于30 mL去離子水中，攪拌至完全溶解成透明溶液，100 wps超聲處理30 min后將其移入100 mL高壓反應釜中，170℃下反應4 h，冷卻至室溫后透析12 h（透析袋截留分子量為3500 Da），旋轉蒸發干燥至一定體積后冷凍干燥，最后將得到固體產物配成50 mg·L-的碳量子點溶液備用。

1.2 碳點基熒光分子印跡探針的制備

準確稱量一定量的3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）和磺胺甲基嘧啶，溶于40 mL溶劑中，攪拌30 min后加入10 mL 50 mg·L-1的碳量子點溶液，100 wps下超聲處理30 min，靜置預聚合4 h。加入50 mg偶氮二異丁腈及20 mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯，混合均勻后將混合溶液轉移至圓底三口燒瓶中，用N2抽吸三次，在N2氣氛中60℃水浴回流24 h。反應結束后，用250 mL甲醇-乙酸混合溶液（V甲醇∶V乙酸=9∶1）對聚合物進行反復洗脫，24 h后用甲醇進一步洗脫至檢測不到模板分子為止。將聚合物置于真空干燥箱中，60℃真空干燥6 h，即可得碳點基熒光分子印跡探針（CQDs-MIP）。熒光非印跡聚合物（CQDs-NIP）的制備方法同上，但不添加磺胺甲基嘧啶。

1.3 CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶的吸附

以CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶的飽和吸附量作為制備工藝條件評價指標。用移液管準確移取10 ml 60 mg·L-1的磺胺甲基嘧啶溶液置于碘量瓶中，加入10 mg CQDs-MIP，置于恒溫搖床中，在室溫下以80 r·min-1的頻率進行振蕩吸附，吸附結束后，用0.22 μm濾膜過濾并取清液用紫外-可見光分光光度計在波長λ=266 nm處測定溶液中磺胺甲基嘧啶的剩余濃度，磺胺甲基嘧啶吸附量 Q（mg·L-1）由式（1）計算[12]。

式中：C0、Ct分別為初始及t時刻磺胺甲基嘧啶溶液濃度，mg·L-1；V表示磺胺甲基嘧啶溶液體積，L；m 為 CQDs-MIP 質量，g。

1.3.1 功能單體用量對CQDs-MIP性能的影響

分別取模板分子與功能單體摩爾比為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12，按步驟 1.2 制備 CQDs-MIP。在10 mL 60 mg·L-1的磺胺甲基嘧啶溶液中加入相應10 mg CQDs-MIP，在室溫下以 80 r·min-1的頻率振蕩吸附至平衡，按式（1）計算吸附量，考察功能單體用量對CQDs-MIP性能的影響。

1.3.2 溶劑對CQDs-MIP性能的影響

分別以乙醇、乙腈、甲醛為溶劑，按步驟1.2制備CQDs-MIP。在10 mL 60 mg·L-1的磺胺甲基嘧啶溶液中加入相應10 mg CQDs-MIP，在室溫下以80 r·min-1的頻率振蕩吸附至平衡，按式（1）計算吸附量，考察溶劑種類對CQDs-MIP性能的影響。

1.3.3 交聯劑對CQDs-MIP性能的影響

分別以乙二醇二甲基丙烯酸酯、N，N-而亞甲基雙丙烯酰胺、二乙烯基苯為交聯劑，按步驟1.2制備CQDs-MIP。在10 mL 60 mg·L-1的磺胺甲基嘧啶溶液中加入相應10 mg CQDs-MIP，在室溫下以80 r·min-1的頻率振蕩吸附至平衡，按式（1）計算吸附量，考察交聯劑種類對CQDs-MIP性能的影響。

1.4 平衡吸附實驗

在碘量瓶中分別加入 10 mL 10～100 mg·g-1的磺胺甲基嘧啶溶液和10 mg CQDs-MIP。在20℃下，以80 r·min-1的頻率振蕩吸附3 h。吸附完成后過濾取清液檢測剩余濃度，計算吸附量并利用Langmuir等溫吸附方程式（2）及Freundlich等溫吸附方程式（3）進行數據擬合分析。

式中：Qe、Qm分別為平衡吸附量及最大吸附量，mg·g-1；Ce為平衡濃度，mg·L-1；b（L·mg-1）、Kf分別為Langmuir吸附系數及Freundlich吸附系數；1/n為Freundlich常數，與吸附強度相關。

1.5 動態吸附實驗

在碘量瓶中加入10 mL 50 mg·g-1的磺胺甲基嘧啶溶液和10 mg CQDs-MIP。分別在20、40、60℃下，以80 r·min-1的頻率進行振蕩吸附，并每隔一段時間取樣分析磺胺甲基嘧啶溶液濃度，計算吸附量并利用準一級動力學模型公式（4）與準二級動力學模型公式（5）進行數據擬合分析。

式中：k1為準一級吸附速率常數，min-1；k2為準二級吸附速率常數，g·mg-1·min-1。

1.6 選擇性吸附實驗

準確稱取100 mg CQDs-MIP置于錐形瓶，分別加入10 mL 60 mg·L-1的磺胺甲基嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶溶液，在室溫下以80 r·min-1的頻率振蕩吸附3 h，過濾后取清液測量吸光度，根據式（1）計算吸附量。CQDs-NIP的吸附量測定方法同上。并根據式（6）、式（7）計算印跡因子I及選擇性系數α，驗證選擇性[13]。

式中：QMIP為CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶的吸附量，mg·g-1；

QNIP為非印記分子對磺胺甲基嘧啶的吸附量，mg·g-1。

Q模板分子為CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶的吸附量，mg·g-1；

Q非模板分子為CQDs-MIP對競爭吸附質的吸附量，mg·g-1。

1.7 CQDs-MIP熒光響應檢測磺胺甲基嘧啶條件研究

將 3 mL 300 mg·g-1的 CQDs-MIP溶液與 1 mL不同濃度的磺胺甲基嘧啶溶液混合，加入pH=6的檸檬酸鹽緩沖溶液定容至10 mL，靜置60 min后，在激發波長λex=365 nm處測定相對熒光強度。

2 結果與討論

2.1 CQDs-MIP制備條件優化

2.1.1 功能單體添加量對CQDs-MIP性能的影響

由于3-氨基丙基三乙氧基硅烷 （APTES）作為擁有較多羥基的新型非乙烯基功能單體，具有可在水相環境下聚合及抑制強極性環境干擾的能力，因此本實驗以APTES作為功能單體[14]。功能單體用量與分子印跡識別功能密切相當。若功能單體用量過少，則生成的模板-功能單體復合物數量不足，洗脫模板后所形成的功能位點數量少，識別效果差[15]。APTES與SMR的磺酰基、氨基通過氫鍵結合成預聚物，又通過氫鍵作用包覆在CQDs表面，通過交聯劑固定并去除模板分子后即可得具有特定空穴形狀的分子印跡聚合物，過程如圖1所示[16]。當功能單體用量過大時，可能導致非選擇性功能位點數量增加，并引發功能單體自聚，反而使識別能力減弱，故而需要對功能單體用量加以優化選擇[17]。由圖2可看出，當功能單體用量為10 mmol時，CQDs-MIP平衡吸附量最大，表明特異性結合功能位點數量最多。故而選擇磺胺甲基嘧啶與3-氨基丙基三乙氧基硅烷的摩爾比為 1∶10。

圖1 CQDs-MIP合成原理圖

圖2 APTES添加量對CQDs-MIP性能的影響

2.1.2 溶劑對CQDs-MIP性能的影響

溶劑一方面可以為聚合反應提供適合的反應環境，另一方面在聚合過程中可在高分子鏈間撐出空間，作為致孔劑來使用，會影響功能單體和模板間的結合強度、聚合物的性能和形態，具有重要的作用[18]。在相同條件下，分別以乙醇、乙腈、甲醛作為溶劑制備CQDs-MIP，并進行吸附實驗。結果表明，以乙腈為溶劑制備的CQDs-MIP平衡吸附量最大，達8.70 mg·g-1，而以乙醇和甲醛為溶劑制備的CQDs-MIP平衡吸附量分別為7.90及8.33 mg·g-1。這主要是由于大孔溶劑形成的大孔結構更有利于物質擴散，從而有利于提高其識別能力[19-20]。因此，乙腈為最適宜制備CQDs-MIP的溶劑。

2.1.3 交聯劑對CQDs-MIP性能的影響

交聯劑可將SM1-APTES聚合物交聯在一起，除去模板分子后，形成具有特殊立體空腔結構形狀和功能基精確排布的聚合物。交聯劑用量對CQDs-MIP的特異性結合能力及構型具有重要影響[14]。若交聯劑用量過少，則SM1-APTES聚合物無法保持穩定的框架結構和空腔形狀，若交聯劑用量過多，又會減少特異性結合位點的數量[18]。在相同條件下，分別以乙二醇二甲基丙烯酸酯、N，N-二亞甲基雙丙烯酰胺、二乙烯基苯為交聯劑制備CQDs-MIP，對應的平衡吸附量分別為8.70、8.04及8.19 mg·g-1。因此，綜合考慮采用以乙二醇二甲基丙烯酸酯作為交聯劑。

2.2 紅外光譜分析

如圖3所示，3426 cm-1為O-H/N-H伸縮振動峰；1630 cm-1為C-O伸縮振動峰[21]。相較于CQDs，CQDs-MIP的紅外光譜曲線出現了新吸收峰，2985 cm-1為APTES中N-H鍵彎曲振動吸收峰[22]；2942 cm-1為C-H鍵伸縮振動吸收峰[23]；1730 cm-1為C=O伸縮振動峰；1438 cm-1為APTES修飾后的氨基伸縮振動吸收峰[24]；954 cm-1處為Si-O-Si不對稱拉伸峰[10]；880～680 cm-1之間出現了苯環CH面外彎曲振動峰[25]。這表明APTES被成功結合在CQDs表面。

圖3 CQDs-MIP的紅外光譜圖

2.3 吸附等溫線

CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶的平衡吸附實驗結果如圖4（a）所示。CQDs-MIP吸附量隨著磺胺甲基嘧啶濃度的增加而增加，在0～30 mg·L-1區間吸附曲線陡峭上升，吸附量迅速增加至6.82 mg·g-1，隨后逐漸變為平緩，當磺胺甲基嘧啶濃度為 100 mg·L-1時，吸附量為 9.04 mg·g-1。這主要是由于在低濃度情況下，CQDs-MIP特異性結合位點數量較為充足，目標分子結合后空置位點數量仍然較多，因而隨著磺胺甲基嘧啶溶液濃度增加，吸附量也隨之增加；當溶液濃度再進一步增加時，CQDs-MIP表面閑置功能位點數量被模板分子占據而銳減，同時在CQDs-MIP表面吸附位形成空間位阻，阻礙了模板分子的靠近，因此吸附量逐漸趨于平緩。對上述數據分別利用Langmuir和Freundlich等溫吸附方程式進行擬合，其結果如圖 4（b）（c）及表 1 所示。擬合結果表明，Langmuir等溫吸附線方程為y=0.1121x+0.7112，R2=0.9854；Freundlich等溫吸附線方程為y=0.4297x+0.3861，R2=0.8852。結果表明Langmuir模型能更好的描述CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶的吸附過程，因此推測CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶的吸附為化學吸附過程，且理論飽和吸附量Qm為8.92 mg·g-1，與實驗值 9.04 mg·g-1接近[12]。1/n 介于0.1～0.5 之間，表明CQDs-MIP有利于吸附磺胺甲基嘧啶。

表1 Langmuir、Freundlich等溫吸附模型參數

圖4 （a）CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶的平衡吸附曲線；（b）Langmuir等溫吸附線；（c）Freundlich 等溫吸附線

2.4 吸附動力學

為了進一步了解CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶的吸附過程，分別在293、313、333K測定不同時間下CQDs-MIP的吸附量。如圖5（a）所示，在任意實驗溫度下，CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶的吸附在10 min左右基本達到吸附平衡狀態，吸附速率如此迅速，也進一步驗證其為化學吸附過程。當溫度為293 K增加至333 K時，平衡吸附量也由4.49 mg·g-1增加至 8.19 mg·g-1，平衡吸附量隨溫度增加而增加，表明其吸附過程為吸熱過程，升溫有利于吸附的進行[24]。

分別采用準一級、準二級動力學模型對數據進行擬合分析，結果如圖5（b）（c）及表 2所示。在3個溫度下，準二級動力學模型擬合相關系數均達0.99以上，表明吸附過程為化學相互作用過程，化學吸附是限制吸附速率的主要因素[13，26]。

表2 不同溫度下動力學模型參數

圖5 （a）不同溫度下CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶的吸附曲線；（b）準一級動力學模型曲線；（c）準二級動力學模型曲線

2.5 選擇性吸附

為了評價CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶的特性異識別能力，對CQDs-MIP進行選擇性吸附實驗，實驗結果如表3所示。CQDs-NIP對三種磺胺類抗生素的吸附能力相當，表現出非選擇性吸附現象。而CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶表現出明顯的吸附優勢，CQDs-MIP對磺胺嘧啶和磺胺二甲基嘧啶的選擇性系數分別為2.28及3.02，表明相較于其余兩種類似物，CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶具有選擇性。結合吸附等溫線及吸附動力學的討論結果，可以推測由于CQDs-MIP不僅具有有效形狀的三維孔穴，并且表面的功能性結合位點對磺胺甲基嘧啶有較強的親和力，因此對磺胺甲基嘧啶具有較強的特異性識別能力和競爭吸附能力[24]。為了驗證CQDs-MIP的3D結構，對其進行BET吸附性能表征，結果如圖6所示。由N2吸脫附曲線結果可知CQDs-MIP符合I型Langmuir等溫吸附線，表明CQDs-MIP具有微孔結構。

表3 CQDs-MIP和CQDs-NIP選擇性吸附結果

圖6 CQDs-MIP的N2吸/脫附曲線

2.6 磺胺甲基嘧啶熒光探針檢測條件優化

CQDs-MIP表面電荷及其與模板分子之間的猝滅反應均受檢測體系pH值的影響[27-29]。實驗結果如圖7所示，結果表明在酸性條件下熒光體系猝滅效果較為顯著，當pH=6時磺胺甲基嘧啶對CQDs-MIP的猝滅強度最大。這可能是由于在強酸條件下CQDs-MIP與模板分子均被質子化發生靜電排斥作用，而在強堿條件下發生印跡層電離，因此削弱了功能位點與模板分子的結合[21，28-29]。故檢測體系pH值選擇為6。

圖7 pH對熒光猝滅強度的影響

熒光強度隨著CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶吸附時間的增加而變化，因此實驗考察了CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶的響應時間，結果如圖8所示。隨著接觸時間的延長，熒光強度逐漸減弱，當響應時間高于60 min時，熒光猝滅強度基本達到穩定狀態，因此選擇60 min作為最佳響應時間。

圖8 響應時間對熒光強度的影響

為了研究CQDs-MIP投加量對檢測系統熒光強度的影響，實驗考察了不同濃度CQDs-MIP在pH=6時的熒光猝滅強度，結果如圖9所示。當CQDs-MIP濃度為300 mg·L-1時，檢測體系熒光猝滅強度最大，因此選擇300 mg·L-1作為最佳檢測濃度。

圖9 CQDs-MIP濃度對熒光猝滅強度的影響

2.7 熒光探針對不同濃度磺胺甲基嘧啶溶液的測定

CQDs-MIP能識別磺胺甲基嘧啶發生熒光猝滅現象，主要基于CQDs與磺胺甲基嘧啶之間發生的電荷轉移現象。當模板分子與特異性功能位點結合時，CQDs作為電子供體將電荷轉移至磺胺甲基嘧啶上而導致熒光猝滅[30]。熒光猝滅強度與模板分子的濃度息息相關，兩者之間的關系可由Stern-Volmer方程進行表達[11]：F0/F=1+Ksv[C]。其中，F0與F分別表示加入模板分子前后的熒光強度；Ksv為Stern-Volmer方程常數；C為磺胺甲基嘧啶溶液濃度。

如圖 10 所示，在 2～100mg·L-1檢測范圍內，熒光強度隨著磺胺甲基嘧啶溶液濃度的增加而減弱，F0/F與[C]之間表現出良好的線性關系，線性方程為 F0/F=0.0344[C]+1.6422，R2=0.9972。結果表明基于熒光猝滅法可以實現CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶的檢測識別。

圖10 不同SMR濃度下的熒光光譜圖（插圖為Stern-Volmer擬合曲線）

3 結論

首先，以摻氮碳量子點作為熒光源，分別以磺胺甲基嘧啶為模板分子、以APTES為功能單體、乙腈為溶劑、乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑制備了熒光分子印傳感器，同時對CQDs-MIP進行紅外表征分析，結果表明APTES成功結合在碳點表面。

其次，以CQDs-MIP為吸附劑，對磺胺甲基嘧啶進行動態平衡吸附實驗，發現其吸附行為能夠用Langmuir吸附等溫模型和擬二階動力學方程進行很好的描述，表明CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶的吸附主要為化學吸附過程，與紅外分析結果一致。

再次，CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶表現出明顯的吸附選擇性，對磺胺嘧啶和磺胺二甲基嘧啶的選擇性系數分別為2.28及3.02。結合吸附等溫線及吸附動力學的討論結果，可以推測由于CQDs-MIP不僅具有有效形狀的三維孔穴，并且表面的功能性結合位點對磺胺甲基嘧啶有較強的親和力。

最后，CQDs-MIP表面的特異性結合位點與目標分子通過氫鍵結合后，電荷由CQDs轉移至目標分子從而導致熒光猝滅現象的發生。在CQDs-MIP濃度為300 mg·L-1、pH值為6、響應時間為60 min的最優檢測條件下，基于熒光猝滅機理可實現對磺胺甲基嘧啶的快速、靈敏、準確檢測，其響應線性范圍為2～100 mg·L-1，線性相關系數R2=0.9972，為環境中抗生素污染物的快速檢測提供了新方法。