基于網絡藥理學克淋通膠囊治療尿路感染的分子作用機制分析*

鄧楹君 劉勝京 高慶和 任 凱 郭 軍

中國中醫科學院西苑醫院（北京 100091）

尿路感染（urinary tract infection,UTI）是腎、輸尿管、膀胱和尿道等泌尿系統各個部位感染的總稱，是最常見的感染性疾病之一，目前已是僅次于呼吸道感染的第二大感染性疾病。大多數尿路感染由來源于腸道菌群的兼性厭氧菌感染引起，還可由表皮葡萄球菌和白念珠菌等感染引起，常見的致病菌有大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、腸球菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌等，西醫治療以抗生素治療為主，但易出現耐藥性[1]，細菌耐藥性產生的機制復雜，一旦產生增加治療難度，是治療過程中面臨的嚴峻挑戰之一。中醫藥治療尿路感染能有效減輕癥狀，并在降低尿路感染復發率方面具有明顯的優勢[2]?？肆芡z囊是經典苗方，由頭花蓼和黃柏組成，廣泛應用于西醫尿路感染、慢性前列腺炎、泌尿系統結石等疾病，前期臨床觀察顯示出克淋通膠囊對濕熱瘀阻證型的輕中度尿路感染、上尿路結石術后的尿路感染均體現出了良好臨床療效[3,4]，但其作用機制還需要進一步探索。本研究利用網絡藥理學的方法，研究克淋通膠囊藥物成分與靶點的相互作用關系和潛在通路，從而預測其治療尿路感染的相關機制，為后續克淋通膠囊的進一步研究和尿路感染的治療提供參考。

材料與方法

一、克淋通膠囊藥物活性成分獲取

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）檢索克淋通膠囊化學成分。其中，TCMSP 檢索條件為藥物口服生物利用度（OB）≥30%，藥物相似性（DL）≥0.18。在PubChem 數據庫中將收集到的化學成分進行確證，并將其化學成分標準化，下載SMILES序列。

二、藥物活性成分作用靶點及疾病靶點的獲取

通過Swiss 數據庫進行作用靶點篩選,篩選規則為probability≥0.9 的靶點。 以“urinary tract infection”為關鍵詞，在GeneCards、OMIM數據庫搜索疾病的靶點，獲得與尿路感染相關的疾病靶點。

三、潛在作用靶點的獲取

利用R 軟件，將上述得到的藥物靶點與疾病相關靶點相映射，得到克淋通膠囊治療尿路感染的潛在作用靶點。

四、蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建

將靶點導入STRING 平臺，設置蛋白種類為“Homosapiens”，combinedscore為0.9，構建克淋通膠囊治療尿路感染的PPI（protein interaction）網絡。利用Cytoscape軟件繪制PPI網絡圖，并利用其cytoHubba插件計算圖中每個節點的degree 值，以篩選克淋通膠囊治療尿路感染的核心靶點。

五、富集分析

將克淋通膠囊治療尿路感染的靶點利用R軟件進行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因、基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。背景數據庫和基因集限定物種為“Homo sapiens”，閾值設置為P＜0.05，即得到功能富集分析中分子功能、生物過程、細胞組分以及信號通路富集分析結果。

六、可視化網絡圖構建

根據上述得到的成分靶點通路，利用Cytoscape構建克淋通膠囊治療尿路感染的可視化網絡圖。

結 果

一、克淋通膠囊藥物活性成分的篩選

基于數據庫，以OB≥30%且DL≥0.18為標準對克淋通膠囊藥物成分進行篩選最終納入65個有效成分。

二、藥物活性成分作用靶點及疾病靶點的獲取

通過Swisstarget 數據庫獲得藥物的相關靶點，經篩選后得到481個與尿路感染相關度較高的靶點。

三、藥物靶點與疾病靶點相映射

利用R 軟件，將上述得到的藥物作用靶點與疾病靶點相映射，得到220個克淋通膠囊治療尿路感染的潛在作用靶點。

圖1 尿路感染靶點-克淋通膠囊活性成分韋恩圖

四、靶點間相互作用分析

蛋白-蛋白互作網絡（PPI 網絡）分析顯示：與尿路感染相關度較高的有AKT1（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase1）、MAPK1（mitogen-activated protein kinase1）、TP53(cellular tumor antigen p53)、TNF（tu-mor necrosis factor）等，是整個網絡的節點蛋白。選取最低相互作用閾值大于0.9的數據，經Cytoscape處理，繪制PPT 蛋白互作網絡圖(如圖2A)，并利用R 軟件將出現頻次前20 的靶點繪制條形圖(如圖2B)。

圖2 核心靶點PPI蛋白互作分析

五、基因本體功能富集分析

（一）核心靶點GO富集分析

靶點GO分析得到具有顯著意義的2753個生物過程，其中分子功能155 個，生物過程2511 個，細胞組分87 個。列出排名前20 的富集結果如圖3 所示，主要有對脂多糖的反應（response to lipopolysaccharide）、對細菌源性分子的反應（response to molecule of bacterial origin）、對氧化應激的反應（response to oxidative stress）等過程。

圖3 核心靶點GO富集分析結果圖

（二）核心靶點KEGG富集分析

靶點KEGG 富集分析共得到172 條具有顯著意義的通路，選取前20條與尿路感染相關度較高的通路（如圖4），主要涉及PI3K-Akt信號通路等。

圖4 KEGG富集分析圖

（三）“藥物-活性成分-作用靶點”可視化網絡圖構建

將通路活性成分及靶點導入Cytoscape軟件，計算Degree值并繪制“藥物-成分-靶點”的可視化網絡圖，見圖5。

圖5 藥物-成分-靶點可視化網絡圖

討 論

苗藥頭花蓼是貴州省特產民族藥和重點培育發展品種之一，味苦辛，性溫，可解毒、散瘀、利尿通淋，配以黃柏清熱燥濕解毒，兩藥合用清利下焦濕熱，用于濕熱下注、熱結膀胱所致的熱淋[5]。中醫理論認為熱淋的產生主要由濕熱致病，《諸病源候論·淋病諸候》中云：“諸淋者，由腎虛而膀胱熱也?！惫视盟幎嘁郧鍩崂麧裢転榉?，克淋通膠囊中藥物雖少，但頭花蓼味苦辛、性溫，苦能清熱解毒，辛能行血散瘀，有利尿通淋之效，黃柏苦寒燥濕，擅清利下焦濕熱，兩藥相合，清而不寒，利濕而不傷陰，共奏通淋之功?，F代藥理學的研究發現，頭花蓼和黃柏的主要成分對泌尿系感染常見致病菌具有良好的抑菌效果和抗炎活性，對多重耐藥性細菌也有良好的作用[6-8],同時，頭花蓼利尿通淋的作用能增加單位時間內腎單位的泌尿量，通過尿液的沖刷作用，減少細菌的附著和減輕炎癥反應[9]。

網絡藥理學基于“藥物-成分-靶點-疾病”的相互作用網絡，通過可視化網絡系統觀察藥物對疾病的干預方式，符合中藥復方治療疾病的“多成分-多靶點-多通路”的作用機制。本研究采用網絡藥理學的研究方法，經篩選后得到克淋通膠囊有效成分65 個，垂釣靶點481個，疾病靶點2170個，映射后得到作用于尿路感染的潛在靶點220 個。體現了克淋通膠囊治療尿路感染具有多成分、多靶點的特點?？肆芡z囊中含有的主要成分有山奈酚、槲皮素、槲皮苷、小檗堿等，山奈酚、槲皮素、槲皮苷均屬于黃酮類化合物，廣泛存在于多種中草藥植物中，現代藥理學研究顯示黃酮類化合物具有廣泛的抗細菌和抗病毒感染的生物活性[10]。山奈酚具有抗炎、抗氧化、抗癌等多種生物活性[11]，槲皮素具有較強的體內外抗菌作用，可抑制多種炎癥因子的表達[12]。槲皮苷具有抗氧化能力，并對致炎因子IL-6、TNF-α和NO具有抑制作用，從而發揮抗炎效果[13]。小檗堿是生物堿類化合物，對多種細菌表達出不同程度的抗菌活性[14]。與在尿路感染的發病中，這些黃酮類化合物共同發揮抗菌作用，抑制病原菌的入侵和粘附、抑制機體炎癥因子的表達，從而起到治療尿路感染，減輕下尿路癥狀的作用。

PPI 分析顯示克淋通膠囊治療尿路感染相關度較高的靶點有AKT1、MAPK1、TP53、TNF等，這些靶點常常出現在全身多種炎癥反應之中，在細胞凋亡、介導炎癥因子的表達和調節免疫等方面發揮著重要作用[15,16]。GO 分析結果顯示克淋通膠囊可能在膜筏、膜微區、質膜筏、細胞基部等位置發揮結合泛素樣蛋白連接酶和受體配體活性等分子功能，通過調節機體對脂多糖的反應、對細菌源性分子的反應、對氧化應激的反應等生物過程起作用。KEGG富集分析顯示主要涉及PI3K-Akt信號通路，AKT1 是PI3K/AKT 通路上的主要因子[17]，AKT1 缺乏增加炎癥中介導中性粒細胞募集的趨化因子的表達，感染期間中性粒細胞中AKT1 表達下調，并與急性炎癥中中性粒細胞的炎癥活動呈負相關[18]。既往實驗研究也印證了克淋通組方的抗炎效果[19]。

綜上所述，本研究應用網絡藥理學研究方法，對克淋通膠囊化學成分與尿路感染相關靶點進行網絡分析，克淋通膠囊可能是通過抑制細菌活性和炎癥因子的表達、恢復尿路黏膜的屏障作用、抑制病原菌的粘附與侵襲等發揮多成分多靶點作用治療尿路感染?？肆芡z囊可用于輕中度的泌尿系感染，并在與抗生素聯用治療復雜性泌尿系感染方面具有一定的臨床應用價值。