基于TLR4/ NF-κB 信號通路研究右美托咪定對腦卒中后中樞痛大鼠的鎮痛機制

黃鼎力 鄒宛蕓 張 英 劉 慶

西南醫科大學附屬中醫醫院疼痛科，四川瀘州 646000

腦卒中后中樞痛（central post-stroke pain，CPSP）是一種由各種腦血管意外導致的相關疼痛，其發生率為8%～11%[1-2]。CPSP 疼痛程度劇烈，常用的鎮痛藥物效果不佳[3]。小膠質細胞是中樞神經系統中重要的免疫細胞，對組織損傷做出迅速反應，并釋放大量炎癥因子[4]。TLR4/NF-κB 信號通路能明顯增加小膠質細胞的活化和炎癥介質的產生[5-6]，右美托咪定是一種選擇性α2 受體激動劑，對小膠質細胞及神經炎癥有強大的調節作用[7-8]。此外，右美托咪定能抑制損傷腦組織中TLR4/NF-κB 信號[9-10]。因此右美托咪定可能通過抑制TLR4/NF-κB 信號活動抑制小膠質細胞活化改善CPSP 大鼠的疼痛。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素（interleukin，IL）-6 和IL-1β 酶聯免疫吸附試劑盒（Abcam，貨號：ab235662）；Iba-1、NeuN 抗體（Abcam，貨號：ab178846、ab177487）；TLR4、NF-κB、pNFκB 抗體（碧云天生物技術有限公司，貨號：AF8171、AF1246、AF5881）；右美托咪定（四川國瑞藥業有限公司，貨號：1909242）；Ⅳ型膠原酶（Gibco，貨號：17104019）。熱板儀（上海玉研科學儀器有限公司；PL-200）；微量進樣針（Hamilton）。

1.2 實驗動物及分組

90 只SD 大鼠（雄性，240～280 g，6～8 周齡）由西南醫科大學城北實驗動物中心提供[許可證號：SCXK（川）2018-17]。實驗通過倫理委員會審批（2016-1A）。隨機選取30 只為假手術組，進行丘腦腹后外側核（ventralis posterolateral，VPL）注射生理鹽水進行傷口對照。剩余60 只進行VPL 注射Ⅳ型膠原酶，造模后3 d 測定熱縮足反射潛伏期（thermal withdrawal latency，TWL），TWL 較術前降低2 s 即認為出現疼痛[11]。造模成功的標準即為右側VPL 出現卒中，且疼痛行為學改變[12]。將TWL 異常的大鼠按隨機數字表法分為模型組和干預組，每組30 只。造模后第4 天開始干預。干預組連續7 d 腹腔注射右美托咪定50 μg/kg，該劑量為治療復雜區域疼痛綜合征大鼠的最佳劑量[13]。模型組注射等量生理鹽水。

1.3 疼痛行為學檢測

每組大鼠10 只，于造模前1 天（T0）、造模后第10 天（T1）、17 天（T2）、31 天（T3）檢測TWL[13]。

1.4 Western blot 檢測各組大鼠VPL 中TLR4、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）及pNF-κB 的表達

在T3時，各組取5 只大鼠采用Western blot 檢測各組大鼠VPL 中TLR4、NF-κB 及pNF-κB 的表達，心臟灌注去除全身血液，取材。采用BCA 法測定蛋白濃度。電泳，轉膜，封閉，孵育抗體，顯影；經Image J 軟件進行定量分析。

1.5 免疫熒光染色檢測大鼠VPL 神經元和Iba-1 的表達情況

在T3時，采用免疫熒光染色檢測大鼠VPL 神經元和Iba-1 的表達情況。左心灌注后，固定、脫水、包埋，切片，孵育抗體。采用熒光顯微鏡觀察。經cellSens軟件進行細胞計數。

1.6 酶聯免疫吸附試驗測定TNF-α、IL-6 和IL-1β水平

在T3時，取10 mg 膠原酶注射點周圍腦組織，充分研磨勻漿，離心10 min（4 000 r/min），取上清液。按照酶聯免疫吸附試驗試劑盒提供的標準步驟測定TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平。

1.7 統計學方法

應用SPSS 17.0 軟件進行統計分析。計量資料采用均數±標準差（）表示，兩兩比較采用t 檢驗，不同時間點的測量采用重復測量方差分析。以P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠不同時間點TWL 比較

重復測量方差分析結果顯示，假手術組及模型組TWL 組間比較、時間點比較及交互作用差異均有統計學意義(P <0.05) 。進一步兩兩比較，組內比較模型組、干預組T1～T3時TWL 低于T0時，T2～T3時TWL低于T1時，T3時TWL 低于T2時(P <0.05)；組間比較：模型組T1～T3時TWL 低于假手術組，干預組T1～T3時TWL 高于模型組(P <0.05)。見表1～2。

表1 假手術組、模型組大鼠不同時間點TWL 比較（，n=10）

表1 假手術組、模型組大鼠不同時間點TWL 比較（，n=10）

注 與假手術組比較，aP ＜0.05；與本組T0 比較，cP ＜0.05；與本組T1比較，dP ＜0.05；與本組T2 比較，eP ＜0.05。TWL：熱縮足反射潛伏期

表2 假手術組、模型組大鼠不同時間點TWL 比較（，n=10）

表2 假手術組、模型組大鼠不同時間點TWL 比較（，n=10）

注 與模型組比較，aP ＜0.05；與本組T0 比較，cP ＜0.05；與本組T1比較，dP ＜0.05；與本組T2 比較，eP ＜0.05。TWL：熱縮足反射潛伏期

2.2 三組VPL 中TLR4、NF-κB、pNF-κB 表達比較

與假手術組比較，模型組VPL 中TLR4 及pNFκB 的表達升高（P ＜0.05）；與模型組比較，干預組VPL 中TLR4 及pNF-κB 的表達降低（P ＜0.05）；三組VPL 中NF-κB 表達比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見圖1。

圖1 三組大鼠VPL 中TLR4、NF-κB、pNF-κB 表達比較（n=5）

2.3 三組VPL 變化情況

與假手術組比較，模型組VPL 神經元數量減少（P ＜0.05）；與模型組比較，干預組VPL 神經元數量差異無統計學意義（P ＞0.05）。見圖2。

圖2 三組大鼠丘腦腹后外側核中NeuN 蛋白的免疫熒光圖像（n=6）

2.4 三組VPL 中炎癥因子及Iba-1 比較

模型組VPL 中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平及Iba-1較假手術升高（P ＜0.05），干預組VPL 中炎癥因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平及Iba-1 較模型組降低（P ＜0.05）。見表3、圖3。

圖3 三組大鼠VPL 中Iba-1 比較（n=5）

表3 三組大鼠炎癥因子表達情況比較（，n=6）

表3 三組大鼠炎癥因子表達情況比較（，n=6）

注 與假手術組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05。TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL：白介素

3 討論

本研究采用VPL 注射膠原酶的方法建立CPSP模型，VPL 是人類CPSP 的重要病變位置之一[15-16]。在當前研究中，大鼠從造模3 d 開始，TWL 明顯降低，并持續至造模后31 d。結合VPL 神經元的數量明顯減少，構建CPSP 模型成功。同時，VPL 中的Iba-1 和炎癥因子的表達明顯上調，提示小膠質細胞介導的神經炎癥在CPSP 大鼠的中樞敏化中起著重要作用。

中樞敏化與參與了CPSP 的發生發展[17]。大腦神經損傷后增殖活化的小膠質細胞釋放多種促炎性細胞因子使痛覺信號在丘腦的傳遞被明顯放大，導致中樞敏化的發生[18-19]。TLR4 與多種炎癥疾病密切相關[10，20]。TLR4能增強NF-κB 的磷酸化并非促進其表達，而NF-κB磷酸化是其活化的標志。pNF-κB 可增強炎癥因子的表達及釋放[21-22]。TLR4 高表達于小膠質細胞，參與小膠質細胞的增值活化及炎癥因子的釋放[23]。當前研究發現，T3時CPSP 大鼠的丘腦腹后外側核中TLR4、pNF-κB 表達上調，結合小膠質細胞標志物Iba-1 的上調，證實TLR4/NF-κB 信號通路參與CPSP大鼠的小膠質細胞引起神經炎癥的病理過程。

右美托咪定能夠改善器官的缺血再灌注損傷、抑制促炎信號通路和減少細胞死亡[24-25]。在當前研究中，CPSP 大鼠的TWL 及VPL 中Iba-1、TNF-α、IL-1β、IL-6 的表達均被右美托咪定所抑制，提示右美托咪定能顯著改善CPSP 大鼠的疼痛，抑制小膠質細胞介導的神經炎癥。同時發現TLR4/NF-κB 信號的活動也受到右美托咪定的抑制。因此，當前研究結果提示TLR4/NF-κB 信號通路可能參與右美托咪定抑制VPL 的小膠質細胞活化及神經炎癥過程。

綜上所述，腹腔注射右美托咪定對CPSP 大鼠產生一定的鎮痛作用，其機制可能是通過TLR4/NF-κB信號通路抑制小膠質細胞增殖活化及神經炎癥進展。