酸粥發酵過程中微生物群落演替及理化特性變化研究

烏有娜，王玉榮，洋洋，雙全*

1(內蒙古農業大學 食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特，010018) 2(湖北文理學院 食品科學技術學院，湖北 襄陽，441000)

酸粥是內蒙古、山西、陜西和廣西等地的一種傳統發酵食品[1-2]，主要以糜米、大米為原料，部分地區也會加入玉米糝和面粉等發酵而成。因其維生素、有機酸等營養成分的含量較高而成為一種老少皆宜的谷物發酵食品[3]。近年來，越來越多的學者對酸粥開展研究，發現微生物在酸粥發酵過程當中起著至關重要的作用。王玉榮等[4]、張青等[5]使用MiSeq高通量測序技術對酸粥樣品的細菌多樣性分析結果發現酸粥中細菌主要是乳桿菌(Lactobacillus)和醋酸桿菌(Acetobacter)。折米娜[6]采用高通量測序技術對酸粥樣品進行真菌多樣性分析，結果發現16份樣品中的子囊菌門(Ascomycota)平均相對含量高達97.54%。秦慧彬等[7]使用超高效液相色譜技術測定山西酸粥游離氨基酸含量發現甜味和苦味氨基酸含量較高。薛建崗等[2]、李文亞[8]在酸粥中檢測到了氨基酸、鈣、磷，并發現發酵后的酸粥總氨基酸含量高于未發酵的糜米。早在2001年陳忠軍[9]已發現酸粥的獨特風味與乳桿菌、酵母菌具有相關性。郭昊翔[10]結合高通量測序和高效液相色譜技術對酸粥的細菌群落演替和代謝產物進行相關性分析發現乳桿菌屬(Lactobacillus)、梭菌屬(Clostridium)和腸球菌屬(Enterococcus)等均與有機酸、維生素的形成有關。

高通量測序作為研究食品發酵過程最關鍵的技術已經得到了快速發展。Illumina公司的MiSeq測序技術現已應用到包括辣椒醬[11]、酒窖泥[12]、腐乳[13]、酸馬奶[14]和米酸湯[15]等傳統發酵食品的核心細菌類群研究。雖然已有酸粥微生物多樣性與營養成分相關研究[6-10]，但是關于酸粥發酵過程中微生物演替與營養成分形成的相關性研究鮮見報道。

本研究為了探究酸粥發酵過程中的微生物群落變化，采用Illumina MiSeq測序技術對不同發酵時間段的酸粥進行細菌16S rRNA V3-V4區與真菌ITS序列測序予以探究，同時測定不同發酵時間段氨基酸含量，并監測其各發酵時間點酸度、可溶性固形物及蛋白質含量變化，使用相關性分析微生物與氨基酸形成規律，以期深度了解酸粥自然發酵過程。就目前酸粥生產規模小、產量少等情況[16]，為現代工業化生產高品質產品提供理論依據與數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糜米(PanicummiliaceumL.)，市售；發酵引子：2020年8月采集自內蒙古鄂爾多斯市農戶家中以糜米和大米為原料自然發酵24～30 h的酸粥；NaOH、甲基紅乙醇溶液、溴甲酚綠乙醇溶液、HCI、硼酸溶液(20 g/L)、H2SO4(優級純)、CuSO4(分析純)、K2SO4(分析純)、Na2CO3(分析純)，天津福晨化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SX-500蒸汽滅菌鍋，日本TOMY公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋，江蘇榮華儀器制造有限公司；UB-7 pH計，美國Denver Instrument公司；SW-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺，蘇州安泰空氣技術公司；JY1002電子天平，上海蒲春計量儀器有限公司；L-8900型氨基酸分析儀，日本日立公司；K9860全自動凱氏定氮儀，中國海能公司；GeneAmp?9700型PCR儀，美國ABI公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酸粥的制備與樣本收集

將糜米淘洗瀝干，按照糜米∶水=1∶3(g∶mL)加入蒸餾水，65 ℃水浴30 min。以采集的家庭自制酸粥為引子，按10%(體積分數)接種量接入冷卻的米湯中，置于30 ℃靜置發酵48 h，分別在發酵0、6、12、18、24、30、36、42和48 h取樣，用于測定各項指標。

1.3.2 理化指標測定

參照GB 5009.237—2016使用pH計測定樣品的pH值；使用全自動折光儀測定樣品的可溶性固形物含量；參照GB 5009.5—2016使用全自動凱氏定氮儀測定樣品的蛋白質含量；參照GB 5009.5—2016 (第一法)測定樣品的氨基酸含量。以上指標每個樣品平行3次。

1.3.3 酸粥細菌和真菌Illumina MiSeq測序

完成酸粥發酵液中基因組DNA提取并利用1%(質量分數，下同)瓊脂糖凝膠電泳檢測，細菌與真菌分別以338F/806R，ITS3F/ITS4R為引物進行PCR擴增。將PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產物。測序由上海美吉生物科技有限公司完成。

測序得到雙端序列數據后，將成對的reads 拼接成一條序列，同時對reads的質量和拼接的效果進行質控過濾，根據序列首尾兩端的標簽序列和引物序列區分樣品得到有效序列，并校正序列方向。參照崔夢君等[17]的方法，采用QIIME(v1.70)平臺，將有效序列以97%的相似度進行分類操作單元(operational taxonomic units，OTU)劃分后進行同源性比對，從而確定細菌和真菌的從門至屬水平的分類學地位，并且進行α多樣性分析。

1.4 數據分析

使用SPSS 26進行數據分析，數據以平均值±標準誤差表示，當P<0.05時組間差異顯著，當P<0.01時組間差異極顯著。使用Origin 2021進行結果可視化。相關性分析選擇Spearman系數，利用微科盟生科云平臺(https://www.bioincloud.tech/)繪制相關性網絡圖。

2 結果與分析

2.1 理化特性分析

如圖1-a所示，發酵過程中pH值整體呈下降趨勢，在發酵0～24 h由4.09快速降至3.26，達到自然發酵酸粥酸度[18]，隨后下降趨勢放緩，發酵前期pH值迅速下降的原因可能是產酸微生物在此階段較為活躍，代謝旺盛，產酸能力較強。整個發酵過程中的pH值在3.12～4.09，能夠抑制有害菌的生長，保證酸粥的品質。酸粥蛋白質含量的整體變化趨勢較小(圖1-b)，從發酵開始就快速積累，直至48 h時達到峰值0.36 g/100 g，與郭昊翔等[19]的結果相似，微生物生長代謝過程中分泌大量的蛋白質可能是其含量增加的原因。發酵過程中可溶性固形物含量變化呈現出與蛋白質含量相同的變化規律，在檢測時間內整體上隨著發酵時間的延長其含量逐漸升高。

a-pH;b-蛋白質和可溶性固形物圖1 酸粥發酵過程中理化指標的變化Fig.1 Changes of physicochemical characteristics of congee during fermentation

氨基酸在發酵過程中可被酵母利用，參與酸粥中的風味物質的合成。從酸粥9個采樣點樣品中共檢測到16種氨基酸，其中谷氨酸與天冬氨酸含量最高，且2種氨基酸是鮮味氨基酸，使食品具有更優良的感官特性。酸粥中乳酸菌的含量較高[8-9]，并且已知乳酸菌可以促進谷氨酸和天冬氨酸的釋放[20]，所以導致樣品中2個氨基酸含量最高的原因可能是乳酸菌。從圖2可以看出，在酸粥發酵前42 h隨著發酵時間的延長多數氨基酸逐漸增加，精氨酸、亮氨酸、丙氨酸、谷氨酸和天冬氨酸在發酵過程中的變化較為顯著。各氨基酸的含量在發酵前期與中期不斷增加，在42 h時減少，但在發酵終點時達到最高值，48 h時總氨基酸含量增加至發酵前(0 h)的2倍。發酵48 h時的必需氨基酸與總氨基酸的比例為39%，接近于聯合國糧食及農業組織/世界衛生組織推薦的蛋白質中必需氨基酸占總氨基酸的百分比[8]，表明酸粥發酵可改善原料營養結構，提升其利用率。

圖2 發酵過程中酸粥氨基酸含量的變化Fig.2 Changes of amino acid content in congee during fermentation

2.2 酸粥發酵過程中微生物群落結構變化

2.2.1 酸粥微生物α-多樣性分析

不同發酵時間段的酸粥樣品16S rRNA序列測序結果共產生738 355條有效序列，ITS序列測序后共產生1 271 953條有效序列，進一步對有效序列進行α多樣性分析，結果見表1。發酵前6 h細菌的Chao 1指數顯著增加，真菌的卻略有下降，可能是由于細菌在生長繁殖過程中釋放出乳酸、乙酸等物質抑制了真菌的生長。發酵30 h開始，Chao 1指數和香農指數均有上升趨勢，可能是一些真菌隨著發酵逐漸適應環境，能夠利用殘留物質進行繁殖。在發酵48 h時微生物多樣性與豐富度指數達到最高值，表明通過發酵細菌和真菌多樣性與豐富度均得到提升。另外可以發現，整個發酵過程中的細菌Chao 1指數、香農指數和辛普森指數大于真菌，說明酸粥的細菌物種多樣性與豐富度均大于真菌。

表1 發酵過程中酸粥細菌和真菌α-多樣性指數Table 1 α-Diversity index of bacteria and fungi in fermented congee

2.2.2 細菌菌群結構特性分析

經過與物種數據庫比對，分別獲得了從門至屬水平的物種分類信息。由圖3-a可知，酸粥細菌主要由厚壁菌門(Firmicutes，91.56%)、變形菌門(Proteobacteria，8.14%)與放線菌門(Actinobacteria，0.03%)構成。隨著發酵的進行，Firmicutes相對豐度雖然有所浮動，但在48 h時的含量仍為最高，相對豐度為93.24%。Proteobacteria在發酵前12 h時達到峰值23.82%，隨后呈現較小浮動，在發酵終點時的豐度為6.49%。由此可知，Firmicutes為酸粥的優勢菌門，郭昊翔[10]使用MiSeq測序技術對酸粥細菌菌群的變化進行分析發現Firmicutes為發酵后期的優勢菌門。

在屬水平下檢測到的相對豐度大于0.1%的細菌屬有隸屬于Firmicutes的乳桿菌屬(Lactobacillus)和腸球菌屬(Enterococcus)，隸屬于Proteobacteria的小坂菌屬(Kosakonia)、勞爾氏菌屬(Ralstonia)和歐文氏菌屬(Erwinia)等。在發酵6～12 h時細菌多樣性最高，與α-多樣性分析結果一致。酸粥發酵過程中的Lactobacillus平均相對豐度為91.53%，為絕對優勢菌屬，與王玉榮等[21]、王成等[22]的結果一致。Lactobacillus在發酵過程中產生以乳酸為主的有機酸，以降低發酵液的pH值來抑制其他微生物生長[23]。Kosakonia、Enterococcus和Erwinia均有先增加后減少的趨勢，可能是由于Lactobacillus所產生的乳酸桿菌素抑制其生長[24]。由此可知，Lactobacillus在保證酸粥品質方面起著重要的作用。

a-門水平；b-屬水平圖3 細菌群落結構組成Fig.3 Structure of bacterial community on phylum level and genus level

2.2.3 真菌菌群結構特性分析

酸粥發酵過程中的真菌群落結構變化如圖4-a所示，優勢真菌門為子囊菌門(Ascomycota)和Anthophyta。Ascomycota在發酵初期的相對豐度為98.53%，隨著發酵時間的增加其含量呈較小浮動，在發酵48 h時下降至91.36%。Anthophyta初始豐度為1.41%，48 h顯著增加至8.39%。雖然隨著發酵時間的延長Ascomycota的豐度有所下降，但是其豐度均大于90%，為酸粥發酵過程中的主要真菌門，與折米娜[6]的結果一致。

在屬水平上，雙足囊菌屬(Dipodascus)與耶氏酵母屬(Yarrowia)為優勢菌屬，在各發酵時間的平均相對豐度分別為47.12%和48.22%，隨著發酵的進行其相對豐度略有下降。雖然畢赤酵母屬(Pichia)含量微弱，但隨著發酵時間的延長其相對豐度卻有所增加，從0.47%增加至1.63%。王玉榮等[4]從內蒙古鄂爾多斯酸粥中分離鑒定出Yarrowia與Pichia。MENDON?A等[25]發現Yarrowia與蛋白水解活性有關。童敏江等[26]對汾酒主要功能微生物進行單菌株發酵實驗，結果發現Pichia具有產乙酸乙酯作用。Dipodascus尚未在酸粥中被發現，鮑奕達等[27]在郫縣豆瓣樣品中檢測到該菌屬并發現其與氨基酸轉胺后的產物具有相關性，因此推測該菌屬可能與氨基酸分解代謝有關，可能是潛在的風味物質產生菌。

a-門水平；b-屬水平圖4 真菌群落結構組成Fig.4 Structure of fungal community on phylum level and genus level

2.3 微生物與理化指標之間的關聯性分析

理化因子與核心微生物屬間的Spearman相關系數的結果表明(圖5)，Lactobacillus、Klebsiella、Kosakonia、Ralstonia、Erwinia、Yarrowia和Dipodascus與pH正相關，與氨基酸負相關，可見酸性環境抑制部分微生物的生長。Pichia與大多數理化特性呈正相關，包括蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸、脯氨酸、蛋白質和可溶性固形物。任宇婷等[28]通過對廣西地區酸粥細菌菌群功能進行預測，發現酸粥中存在的Pichia與氨基酸代謝有關，因此推測總氨基酸在42 h時突然下降的原因也可能是Pichia在此發酵階段的豐度最高。Pichia與pH呈負相關，可能是由于其生長pH值比較寬(pH 3～7)，且較適宜酸性環境，因此在一定范圍內pH值越小、酸度越大，越適宜Pichia的生長。

注：正相關和負相關分別用紅色和藍色表示圖5 酸粥核心微生物與理化特性的相關性Fig.5 Correlation between physicochemical indicators and microbial diversity in fermented congee

3 結論

本研究基于高通量測序方法分析不同發酵時間段酸粥的微生物變化，結果發現整個發酵過程以隸屬于Firmicutes的Lactobacillus為絕對優勢細菌屬，優勢真菌屬為Yarrowia、Dipodascus和Pichia。對酸粥理化指標進行測定發現，通過發酵酸粥pH下降，蛋白質、可溶性固形物均有所上升，pH值的下降有效抑制了部分條件致病菌的生長。氨基酸作為揮發性風味化合物的前體物質在發酵過程中亦呈上升趨勢，且氨基酸組成更為合理。對酸粥微生物群落與理化指標進行相關性分析，結果發現pH和氨基酸對酸粥微生物群落有較大影響，因此控制酸粥發酵酸度對產品安全性與風味有著至關重要的作用。