基于高通量靶向代謝組學篩選PCOS患者卵泡液差異游離脂肪酸

程銘，賈嬋維，馬延敏，劉英

(首都醫科大學附屬北京婦產醫院生殖醫學科，北京 100026)

多囊卵巢綜合征(PCOS)為育齡女性最常見的生殖內分泌疾病，是引起女性月經紊亂、排卵障礙性不孕、高雄激素和胰島素抵抗的重要原因[1]。PCOS作為一種與多種代謝紊亂相關的復雜疾病，相關代謝紊亂引起的代謝物改變可能會影響卵巢卵泡[2]，其獨特的代謝特征往往反映在卵泡液組成中。常見的代謝性疾病可導致過度的脂肪分解使游離脂肪酸(FFA)水平升高，FFA是異常脂質代謝的重要生物指標[3]，在女性卵泡液中FFA含量的變化會影響卵母細胞的成熟和發育[4]，導致卵母細胞生長和分化的改變[5-6]。既往關于PCOS患者卵泡液的檢測，主要集中在運用非靶向代謝組學獲取廣泛的代謝物類別，有學者通過超高液相色譜-四級桿飛行時間質譜聯用技術發現脂肪酸類代謝物表達存在差異[7]，而靶向代謝組學技術具有更高靈敏性和選擇性，可以在非靶向的基礎上定量分析特定的代謝物濃度[8]，從而對非靶向結果加以驗證和擴展[9]。

本研究采用氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)技術高通量靶向定量檢測PCOS患者卵泡液中的FFA濃度，運用單元與多元變量統計分析方法篩選與PCOS相關的差異FFA，通過分析可能參與的代謝通路，找到差異FFA的共上下調相關性，初步探索影響PCOS卵巢功能的相關因素，增加對PCOS患者發生的復雜代謝過程的了解，為預測和改善PCOS患者卵母細胞質量和體外受精治療結局提供思路。

資料與方法

一、研究對象

選取2021年3月—12月在我院生殖醫學科接受體外受精/卵胞漿內單精子注射(IVF/ICSI)治療的不孕患者(年齡<40歲)為研究對象。行IVF/ICSI治療的PCOS患者(13例)為PCOS組，其納入標準依據鹿特丹標準[10]并排除臨床表現與PCOS 類似的非PCOS患者；對照組為平素月經周期和排卵規律、因女性輸卵管因素和(或)男性因素行IVF/ICSI患者(8例)。兩組患者同時排除高催乳素血癥、子宮內膜異位癥、卵巢早衰、卵巢缺如，且入組前1個月患者均未接受過性激素、胰島素、血糖代謝的藥物。本研究經首都醫科大學附屬北京婦產醫院倫理委員會批準，所有患者在研究前均簽署知情同意。

二、主要試劑與儀器

1.主要試劑：硫酸甲醇溶液(Thermo，美國)；正己烷(蘇州永華)；無水硫酸鈉(北京國藥集團)；水楊酸甲酯(TCI，日本)。

2.主要儀器：Thermo TG-FAME毛細管柱(Thermo，美國)；TSQ 9000質譜(Thermo，美國)。

三、實驗方法

1.樣本采集：經陰道超聲引導下穿刺取卵時收集無血染的卵泡液，3 000 轉/min 4 ℃離心10 min后分離上清，分裝入1.5 ml無菌離心管中，于-80℃冰箱保存備用。

2.樣本預處理：吸取50 μl卵泡液于15 ml離心管中，加入2 ml 1 %硫酸甲醇溶液，充分混勻震蕩1 min，80℃水浴鍋中酯化30 min；取出后冷卻，加入1 ml正己烷萃取，振蕩混勻30 s，靜置5 min，加入5 ml H2O(4℃)洗滌，3 500轉/min 4 ℃ 離心10 min；吸取700 μl上清液于2 ml離心管中，加入100 mg無水硫酸鈉粉末除去多余水分，振蕩混勻30 s，12 000轉/min離心5 min；吸取300 μl上清液于2 ml離心管中，加入15 μl 500 ppm水楊酸甲酯作為內標，振蕩混勻10 s；吸取200 μl上清液加入到檢測瓶中待檢測。所有樣本均間隔數針隨行質量控制(QC)檢測。

3.GC-MS檢測：色譜柱使用Thermo TG-FAME毛細管柱(50 m×0.25 mm ID×0.20 μm，Trace 1300)；進樣量1 μl，分流比8∶1。進樣口溫度250 ℃，離子源溫度300 ℃，傳輸線溫度280 ℃。程序升溫起始溫度80 ℃，保持1 min；以20 ℃/min升至160 ℃，保持1.5 min；以3℃/min升至196℃，保持8.5 min；最后以20 ℃/min升至250 ℃，保持3 min。載氣為氦氣，載氣流速0.63 ml/min。質譜使用電子轟擊電離源，SIM掃描模式，電子能量70 eV。

4.數據采集和預處理：按照上述GC-MS條件對待測樣本進行數據采集，根據標準樣品出峰面積繪制標準曲線，計算線性回歸方程，并對結果進行定性和換算處理。數據從下機的raw格式通過Xcalibur軟件轉置成CDF格式進行后續的數據分析。其中采用主成分分析法(PCA)通過主成分對各組數據歸類，從而直觀反映各個樣本的聚集和離散程度；結合正交偏最小二乘法-判別分析法(OPLS-DA)對樣本進行指定并分組，對數據降維的同時結合回歸模型并進行判別分析，從而使FFA的組間差異可視化，并經其置換檢驗評估檢驗模型是否存在過擬合現象。

四、統計學分析

通過獨立樣本t檢驗對兩組樣本的每個變量進行計算求P值，當0.01≤P<0.05則認為有顯著差異，當P<0.01則認為有極顯著差異。用Pearson相關對兩組樣本的差異FFA開展相關性分析，用r反映兩個變量的相關性程度。r的絕對值越接近1，表示兩變量之間直線聯系越密切；當r為負值時，表示兩個變量的變化方向相反，稱為負相關；當r為正值時，表示兩個變量的變化方向一致，稱為正相關。將原始定量數據導入R軟件進行多元統計分析處理。運用OriginPro 2022(OriginLab Corporation，Northampton，MA，美國)軟件分別繪制火山圖、層次聚類分析熱圖和相關熱圖，數據分析流程見圖1。

圖1 數據分析流程圖

結 果

一、主成分分析(PCA)

PCA得分圖可直觀地觀察樣本的聚集和離散程度，樣本分布點越靠近，說明這些樣本中所含變量的組成和濃度越接近；反之，樣本點分布越遠離，其所含變量的組成和濃度差異越大。在該PCA得分圖(圖2)中每個點代表一個對應的樣本，兩組卵泡液樣本的點分別聚集在一起，說明兩組卵泡液樣本的各個樣本之間的相似性非常高，且兩組卵泡液樣本對應的散點在組內呈現互相聚集的現象，說明組內的重復性較好，樣本數據非常相似，組間具有較好的區分度。

紅色圓點代表對照組患者的卵泡液樣本，綠色圓點代表PCOS組患者的卵泡液樣本。

二、OPLS-DA分析結果

正交偏最小二乘法-判別分析法(OPLS-DA)使用正交信號校正技術，在不降低模型預測能力的前提下，過濾掉樣本中與模型分類不相關的正交信號，從而使FFA的組間差異可視化。各卵泡液樣本的OPLS-DA得分圖結果顯示，PCOS組和對照組組內分布均勻，組間FFA分布具有差異性(圖3)。為防止檢驗模型出現過擬合，對其進行OPLS-DA的置換檢驗(Permutation test of OPLS-DA)，結果如圖4所示，R2Y為模型Y變量的可解釋度，其值越接近1，說明建立的模型符合樣本的真實情況；R2X值代表模型可解釋的變量；Q2值為通過交叉驗證計算得出的用以評價模型的預測能力，其值越接近0.5，說明該模型的可預測性越好。該圖中Q2值的回歸線在Y軸上的截距小于0說明該模型具有良好的穩定性，不存在過擬合現象。

紅色三角形代表對照組，綠色加號代表PCOS組。橫坐標表示主要成分得分值(Tp)，反映組間的差異；縱坐標表示正交主成分得分值(TO)，反映組內樣本間的差異。

橫坐標表示置換檢驗得到的分組變量與原始分組變量的相關性，縱坐標表示R2Y及Q2值，綠色圓點表示置換檢驗得到的R2Y值，藍色方點表示置換檢驗得到的Q2值，兩條虛線分別表示R2Y及Q2值的回歸線。

三、PCOS患者卵泡液差異FFA的篩選

以獨立樣本t檢驗對兩組卵泡液樣本的每個變量進行計算求得的P值小于0.05，同時兩組樣本表達差異倍數(FC)值大于1.2為標準對PCOS患者卵泡液中的差異FFA進行篩選。結果以火山圖的形式可視化呈現?；鹕綀D中的每個點代表一個FFA，橫坐標表示PCOS組比對照組的差異表達倍數(取以2為底的對數)，點越偏離中心表示差異倍數越大；縱坐標表示經獨立樣本t檢驗的P值(取以10為底的對數)，點越靠近圖頂部表示差異越顯著。結果表明，在PCOS患者卵泡液中篩選出28種差異FFA，其中有21種FFA上調表達(P<0.05，FC>1.2)，有7種FFA下調表達(P<0.05，FC>1.2)(圖5)。我們對每批卵泡液間隔數針隨行質量控制(QC)檢測，通過標準品與內標的峰面積比值計算所有QC的相對標準偏差(RSD)，來評價方法的穩定性，所有樣本均質檢合格(圖6)。

紅色表示顯著上調的FFA，藍色表示顯著下調的FFA，灰色表示非顯著差異的FFA。

圖6 質量控制總離子流色譜圖

四、PCOS患者卵泡液中差異FFA的鑒定

對差異FFA的定量值做層次聚類(hierarchical clustering)分析，結果以熱圖的形式呈現。結果顯示，與對照組相比，PCOS組患者卵泡液中的己酸(C6：0)、十一烷酸(C11：0)、十三烷酸(C13：0)、反-9-肉豆蔻烯酸(C14：1T)、順-9-棕櫚油酸(C16：1)、十七烷酸(C17：0)、異油酸(C18：1N7)、亞油酸(C18：2N6)、γ-亞麻酸(C18：3N6)、α-亞麻酸(C18：3N3)、二十一烷酸(C21：0)、山崳酸(C22：0)、HOMO-γ-亞麻酸(C20：3N6)、巴惟酸(C22：1N9T)、順-11，14，17-二十碳三烯酸(C20：3N3)、花生四烯酸(C20：4N6)、二十三烷酸(C23：0)、順-13，16-二十二碳二烯酸(C22：2)、木蠟酸(C24：0)、順-7，10，13，16-二十二碳四烯酸(C22：4)、DPA(C22：5N3)水平顯著上調(P<0.05)，而月桂酸(C12：0)、順-9-肉豆蔻烯酸(C14：1)、反-10-十五烯酸(C15：1T)、順-10-十五烯酸(C15：1)、反油酸(C18：1N9T)、反-11-二十碳烯酸(C20：1T)、順-11-二十碳烯酸(C20：1)水平顯著下調(P<0.05)(圖7)。

橫坐標為樣本名，代表不同實驗分組，每一列代表一個樣本；縱坐標為差異FFA；圖中FFA的相對含量大小通過不同顏色呈現。標尺示差異FFA的相對表達量的高低，顏色越紅表示該FFA的表達量越低，顏色越藍表示該FFA的表達量越高。

五、差異FFA的代謝通路分析

為進一步探索PCOS患者卵泡液中差異FFA的變化與代謝通路之間的關系，通過MetaboAnalyst5.0對得到的差異FFA以SMPDB代謝物數據庫為背景進行相關代謝通路的富集分析，從而篩選出與FFA差異相關性最高的關鍵通路。代謝通路分析的結果以氣泡圖的形式呈現。結果顯示，差異FFA匹配到與脂肪酸代謝密切相關的6條通路，分別是α-亞麻酸和亞油酸代謝、超長鏈脂肪酸的β-氧化、脂肪酸生物合成、短鏈飽和脂肪酸的線粒體β-氧化、中鏈飽和脂肪酸的線粒體β-氧化、花生四烯酸代謝(圖8)。

縱坐標為每一個氣泡對應的代謝通路名稱，橫坐標為P值，-log10(p-value)值越大，P值越小。氣泡越大代表富集到該通路的FFA數目越多，氣泡顏色反映P值大小。

六、差異FFA的相關性分析

通過計算兩組差異FFA兩兩之間的Pearson相關系數來分析各個代謝物之間的相關性。結果顯示，PCOS卵泡液中表達上調的己酸(C6：0)、十一烷酸(C11：0)、十三烷酸(C13：0)、十七烷酸(C17：0)之間，異油酸(C18：1N7)、亞油酸(C18：2N6)、γ-亞麻酸(C18：3N6)、α-亞麻酸(C18：3N3)之間，HOMO-γ-亞麻酸(C20：3N6)、花生四烯酸(C20：4N6)、木蠟酸(C24：0)、DPA(C22：5N3)之間均具有顯著正相關性(P<0.05)；PCOS卵泡液中表達下調的月桂酸(C12：0)、順-9-肉豆蔻烯酸(C14：1)、反-10-十五烯酸(C15：1T)、順-10-十五烯酸(C15：1)、反油酸(C18：1N9T)、反-11-二十碳烯酸(C20：1T)、順-11-二十碳烯酸(C20：1)之間均具有顯著正相關性(P<0.05)；上調的己酸(C6：0)、十一烷酸(C11：0)、十三烷酸(C13：0)、十七烷酸(C17：0)與下調的差異FFA之間有顯著負相關性(P<0.05)(圖9)。

橫縱坐標代表兩組差異FFA，不同位置色塊顏色深淺代表對應坐標的兩個代謝物的相關系數大小，紅色代表正相關，藍色代表負相關，×代表非顯著相關性。

討 論

卵巢是卵母細胞發育和排出、分泌性激素的重要生殖器官。卵泡液是卵母細胞在體內發育中的微環境，其組成包括卵泡生長和卵母細胞成熟所必需的成分以及卵母細胞和顆粒細胞排泄的代謝物[11-12]。卵泡液的代謝組成可能反映卵母細胞和顆粒細胞的質量[13]。低生育力可能會導致正常的生理代謝失衡，引入代謝組學技術能更好地在分子水平上評估女性生育力，了解卵母細胞發育過程中的代謝變化，以期提高卵母細胞的質量，從而獲得優質胚胎[14]，進而有助于改善輔助生殖治療結局[15]。目前對卵母細胞的質量評估主要基于對卵丘-卵母細胞復合體的形態學觀察，具有人為觀察和鑒定的主觀性；而卵泡液在IVF治療過程中容易獲得，且非侵入性的代謝組學檢測技術可識別與疾病特定表型相關的潛在生物標志物和代謝途徑，可作為預測卵母細胞質量的指標以及補充對胚胎形態學的評估，進而深入了解其背后的機制[8]。

既往研究發現，PCOS患者血清中的代謝異常與FFA、溶血磷脂等脂質代謝異常相關[16-18]，同時PCOS患者的卵泡液也具有其獨特的代謝特征[19]。有報道在PCOS患者卵泡液中鑒定出21種不同的代謝物，其中與脂肪酸代謝障礙相關的肉堿合成途徑是其關鍵代謝途徑之一，可誘發脂肪酸代謝功能障礙的7β-羥基膽固醇[20]可能是PCOS的一種潛在代謝標志物[21]。本研究采用GC-MS技術高通量靶向定量檢測PCOS患者和非PCOS患者卵泡液中FFA的濃度，通過單元和多元變量統計分析篩選出28種差異表達的FFA，其中有21種差異FFA表達上調，包括異油酸、亞油酸、γ-亞麻酸、α-亞麻酸、花生四烯酸等，7種差異FFA表達下調，包括月桂酸、順-9-肉豆蔻烯酸、反油酸等，進一步驗證了PCOS患者卵泡液中存在FFA的代謝變化且FFA濃度并非只升高不降低，這為既往的研究結果進行了補充[4]。

FFA水平的升高被認為是女性生育力低下的重要因素。PCOS患者卵泡液中濃度升高的FFA與形態不佳的卵丘-卵母細胞復合體之間存在關聯[22]，表明過量的FFA會對卵泡的功能產生不利影響。既往研究表明，升高的FFA不僅會干擾葡萄糖代謝，也影響胰島素受體及其信號傳導，FFA是引起胰島素抵抗的最主要非激素物質之一[23]。PCOS患者卵泡液中葡萄糖轉運障礙，可利用葡萄糖減少，從而啟動脂肪酸等代謝途徑來代償能量供應不足，而這些代償機制會造成卵泡液中脂類、酮體等水平的改變[24]。這可能是PCOS患者卵母細胞質量較差的原因。Mu等[25]研究證明，飽和脂肪酸如棕櫚酸和硬脂酸通過誘導人卵巢顆粒細胞凋亡從而使細胞死亡；而多不飽和脂肪酸如花生四烯酸即使在超生理濃度下對細胞存活無影響，反而對棕櫚酸和硬脂酸誘導的細胞凋亡有保護作用。這提示FFA對顆粒細胞存活的影響可能參與生殖異常的機制。此外，花生四烯酸及其衍生物的釋放在卵母細胞成熟過程中受到卵泡刺激素和黃體生成素的調節[26]。本研究中，我們發現在PCOS卵泡液中異油酸、亞油酸、γ-亞麻酸、α-亞麻酸、花生四烯酸等表達上調，且通過差異FFA富集到α-亞麻酸和亞油酸代謝、花生四烯酸代謝等代謝通路，結合上述研究，表明這些代謝途徑可能參與導致PCOS患者不良生殖結局的機制。

作為人體必需脂肪酸的α-亞麻酸和亞油酸需維持在一定的生理水平，且飽和/不飽和脂肪酸的比例也可能會影響到卵母細胞的發育能力[4]。Niu等[6]研究結果顯示，油酸、棕櫚酸、硬脂酸、十一烷酸、肉豆蔻烯酸和亞油酸是卵泡液中主要的FFA；PCOS患者的卵泡液中兩種長鏈脂肪酸(棕櫚酸和油酸)水平明顯升高，肥胖PCOS患者卵泡液中亞油酸濃度高于非肥胖PCOS患者和非PCOS患者。這些結果表明，卵泡細胞以不同的速率代謝特定的FFA，一些FFA可能會被優先運輸到卵泡中進行分解代謝。在本研究中，PCOS患者卵泡液中表達上調的FFA之間存在共上調關系，表達下調的FFA之間存在共下調關系，同時一些表達上調的FFA與表達下調的FFA之間存在顯著負相關，說明活躍的機體代謝活動遠比單一的代謝不平衡所能解釋的要復雜得多[11，27-28]。因此，研究多類化合物組合預測生殖結局至關重要，代謝組學讓我們更加全面了解發育中的卵母細胞和胚胎的營養情況以及女性生殖內環境，這對診斷和改善生育治療的結局具有潛在影響。

綜上所述，本研究建立了基于高通量靶向代謝組學技術篩選卵泡液中差異FFA的方法。我們發現，與非PCOS患者相比，PCOS患者的卵泡液中有28種FFA水平發生變化，其中有21種FFA表達水平上調，7種FFA表達水平下調，且存在表達上調的FFA相互間共上調、表達下調的FFA相互間共下調的關系。結果提示PCOS患者部分脂肪酸的代謝改變可能會影響卵泡生長的微環境，影響卵巢功能。此外通過相關代謝通路的富集分析，初步探索PCOS患者體內可能參與的重要脂肪酸代謝通路，對未來尋找影響卵母細胞發育過程中的信號通路有指向作用。