microRNAs與腫瘤寡轉移的研究進展

李寶寶 郭愛紅 王丙聚 吳曼玲 李 珊 路昭穎 郝瑛子

延安大學咸陽醫院神經內科，陜西咸陽 712000

目前，惡性腫瘤進展階段主要分為原發病灶及遠處轉移。眾所周知，根治性手術常用于治療原發灶，而對已發生遠處轉移的患者多予以姑息治療。對于腫瘤轉移，可能忽視了存在其中的異質性差異。1995年，Hellman 與Weichselbaum 認為在腫瘤轉移過程中可能存在介于腫瘤的原發灶與廣泛轉移之間的中間階段，并首先提出“寡轉移”這一概念。此概念提示治療局部腫瘤極有可能改善處于寡轉移階段患者的生存情況，甚至治愈腫瘤。MicroRNAs（miRNAs）已被人們發現參與調控腫瘤寡轉移，因此深入了解腫瘤寡轉移，并且熟知寡轉過程中miRNAs 及其靶分子的作用機制與功能，將會為今后的診斷與治療提供一定的幫助。

1 腫瘤的寡轉移

隨著臨床及基因組數據逐漸積累，腫瘤寡轉移目前定義為不超過5 個部位的遠處轉移。盡管人們對寡轉移認識逐漸加深，但有關寡轉移分子及基因組學的研究仍然有限。目前針對寡轉移形成存在兩種假設：①起源差異，即寡轉移與多灶轉移間存在遺傳性分子及表型差異；②寡轉移只作為廣泛轉移發展過程中早期且短暫的階段。Gerlinger 等在轉移瘤細胞中發現，腫瘤轉移灶與原發腫瘤雖具有相同的突變事件但仍存在異質性。然而，寡轉移的具體產生時機及相關調控機制仍不明確。寡轉移與多灶轉移的兩種不同假設見圖1（封三），提示寡轉移形成過程可在一定程度上反映目前存在的兩種假設。

圖1 寡轉移與多灶轉移的兩種不同假設（見內文第29頁）

隨著高通量基因組學、轉錄組學與蛋白質組學的發展，人們普遍認為轉移瘤的形成涉及多個步驟，寡轉移與多灶轉移的分化可能起始于轉移過程的不同階段。目前的臨床研究也證實，至少三類的患者出現寡轉移：①最初診斷即為寡轉移；②在原發腫瘤完整切除后又出現寡轉移；③減瘤性治療后產生寡轉移。這提示明確腫瘤轉移過程中發生寡轉移與多灶轉移的具體階段以及確定不同階段的分子標記物，對臨床診斷與治療至關重要。不斷積累的研究顯示，miRNAs 可能在腫瘤寡轉移過程中,發揮重要的調控機制。

2 miRNAs 與腫瘤寡轉移

2.1 miRNAs 參與腫瘤轉移的分子學基礎

miRNAs 是一類小非編碼RNA，它們可結合靶mRNA 3′末端非編碼區（untranslated regions，UTR），導致靶mRNA 降解或抑制其翻譯。部分miRNAs 在腫瘤的發生、轉移等過程中發揮重要作用。miRNAs 基因常位于染色體脆弱位點，在腫瘤發生、發展中，其正常調控功能常被解除。

miRNAs 在腫瘤轉移級聯步驟中機制廣泛。Lujambio 等發現，miRNAs 受p53 與myc 調控，并由此確定是否激活原發腫瘤初始增殖所必需的增殖機制。此外，在腫瘤轉移的級聯步驟中，miRNAs 可參與調節上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）。既往研究發現，多種miRNAs，如：miR-199、miR-214、miR-193a-3p、miR-210-3p 及miR-200 家族等，經下游信號換能器和轉錄激活器（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、ZEB1 等分子參與，使腫瘤發生EMT。同樣，在轉移細胞黏附階段，miR-31 及miR-26a 可分別在RhoA（ras homolog family member A）、ITGA5（integrin subunit α 5）、Rb1（Rb transcriptional corepressor 1）及ras 同源家族成員A（E2F transcription factor 1，E2F1）分子參與下，介導循環腫瘤細胞黏附。在最后的轉移定植階段，miR-17可抑制血小板反應蛋白1，從而促進腫瘤血管生成；同時，在缺氧誘導下miR-210 可穩定線粒體并調控細胞存活與增殖。上述miRNAs 在腫瘤轉移過程中涉及的廣泛作用，是其調控寡轉移的重要分子基礎。

2.2 miRNAs 在寡轉移中的分子機制

目前已有研究表明miRNAs 可通過調控下游靶基因及蛋白參與寡轉移。Lussier 等通過無監督聚類分析（unsupervised hierarchical clustering）發現，轉移相關miRNAs 可確認部分寡轉移階段以及廣泛轉移階段的轉移樣本。表明某些miRNAs 表達模式可能同時存在于腫瘤寡轉移與廣泛轉移階段，且不同的miRNAs 表達模式可能構成了寡轉移與多灶轉移的分子基礎。

有研究發現，14q32.2 區基因可編碼多種寡轉移相關miRNAs，且已發現該位點內表達的多個miRNAs可抑制腫瘤細胞EMT；在寡轉移細胞內，該區編碼的miR-127-5p、miR-369-3p、miR-544a 與miR-655-3p表達顯著上調，提示這些miRNAs 可共同調控靶基因從而介導腫瘤細胞黏附、侵襲及遷移作用（cell adhesion，cell invasive and cell motility，AIM）。過表達miR-369-3p、miR-544a 及miR-655-3p 后，寡轉移細胞間黏附顯著抑制，且四種miRNAs 均可明顯抑制寡轉移細胞侵襲性，表明14q32.2 區編碼miRNAs在調節寡轉移細胞表型上有重要作用。以往研究顯示，轉化生長因子受體2（transforming growth factor beta receptor 2，TGFBR2）、Rho 相關卷曲蛋白激酶2（rho associated coiled-coil containing protein kinase 2，ROCK2）、胞周期蛋白依賴性激酶抑制物（inhibitor of cyclin-dependent kinase，ICK）及鈣黏蛋白11（cadherin 11，CDH11）基因參與介導AIM 過程，且這些基因都存在可供miRNA 結合的3′UTR 區。經檢測上述基因可作為14q32.2 區編碼miRNAs 的靶基因，共同上調寡轉移細胞miR-655-3p、miR-544a 與miR-655-3p、miR-127-5p 后，TGFBR2、ICK 及ROCK2、CDH11 基因表達明顯抑制，值得注意，單獨過表達miR-369-3p 可同時抑制4 種基因表達，提示上述miRNAs可能競爭性抑制促轉移基因表達。進一步進行離體及在體實驗證實，shRNA 敲低TGFBR2 和ROCK2 基因后，寡轉移細胞間黏附力與侵襲力都明顯減弱。提示寡轉移細胞內可能存在miR-127-5p/miR-544a/miR-655-3p-TGFBR2/ROCK2/ICK/CDH11 信號通路，調節其黏附及侵襲作用，但此通路是否還存在下游靶分子及相關具體通路仍需探討。

miRNAs 也參與調節寡轉移細胞轉移。Lussier 等將上調了miR-200c 功能的寡轉移細胞植入小鼠后，發現寡轉移細胞發生了明顯的多灶轉移。雖然研究表明miR-200c 在抑制或促進腫瘤轉移中都發揮一定作用，但這主要取決于轉移所處階段。由于以往研究顯示miR-200c 以抑制轉移為主，Lussier 等團隊在低轉移表型的黑色素細胞瘤細胞內重復驗證后，發現了明顯的多灶轉移，表明miR-200c 可增強寡轉移細胞的轉移能力。另外，該課題組還發現，在miR-200c功能上調的寡轉移細胞中，ZEB1 與ZEB2 mRNA 表達水平明顯下調，同樣FGD1 與NEDD4 表達水平也明顯下調。既往基因預測分析證實，FGD1、NEDD4 是miR-200c 的潛在靶基因。同時有研究報道Zeb1 與Zeb2 基因為miR-200c 特異性下游靶基因，并與miR-200c 表達呈負相關，且NEDD4 也已發現可通過抑制TGF-β 通路抑制EMT。上述結果不僅說明miR-200c 有靶向特異性，也提示miR-200c 可能通過miR-200c-ZEB1/ZEB2 通路或miR-200c-FGD1/NEDD4-EMT 通路調控寡轉移進展。Sun 等在其構建的寡轉移細胞系中發現，Sec23a 可同樣作為miR-200c 的靶基因。且過表達miR-200c 或下調Sec23a都可促進細胞轉移及定植。值得注意的是，已鑒定的Sec23a 調控蛋白S100A8 可通過結合B 淋巴細胞瘤-2 基因（BCL2 apoptosis regulator，BCL-2）促進自噬。這提示自噬可能也參與寡轉移，為今后研究寡轉移提供了新的思路。

3 miRNAs 對寡轉移的臨床價值

在臨床應用上，miRNAs 扮演重要的寡轉移分子標記物角色，并發揮潛在的治療作用。Oshima 等使用納米配位聚合物（nanoscale coordination polymers，NCP）將寡轉移相關miR-655-3p 植入結直腸癌肝轉移細胞后，發現腫瘤定植明顯減少，寡轉移細胞TGFBR2、ICK 基因表達顯著降低。Chan 等通過進一步的研究證實，PTTG1、SENP6 表達水平也同樣下調。有研究報道，TGFBR2 可激活TGF-β 信號通路，并調控G1/S 期檢查點，從而促進腫瘤細胞轉移；且下調PTTG1 與SENP6 可分別誘導細胞退出細胞周期及抑制DNA 合成。這提示miRNAs 或可通過調節DNA合成及細胞周期影響寡轉移。還發現，與miR-655-3p共培養48 h 后，肝轉移細胞核β-catenin 顯著下降，以往研究顯示，β-catenin 可通過干擾轉錄而介導腫瘤轉移并經Wnt/β-catenin 通路影響EMT。因此這一結果暗示EMT 在寡轉移中發揮潛在作用。

隨著手術、立體放射治療（stereotactic body radiotherapy，SBRT）等治療手段用于治療寡轉移，越來越多的研究發現，寡轉移患者在治療后可獲得長期生存。Wong 等發現，miRNAs，如：miR-23b、miR-449a、miR-449b 可預測寡轉移患者在立體放射治療后的腫瘤生物學及臨床結果。這意味著miRNAs 將有助于選擇可能受益于SBRT 的寡轉移患者。miRNAs對預測寡轉移患者預后與復發也有重要意義。Uppal等發現，寡轉移細胞內miRNAs（miR-655-3p、miR-544a 與miR-655-3p、miR-127-5p）表達情況，與肺轉移瘤手術切除后復發時間呈正相關，值得注意，在miRNAs 表達上調的患者中，60%的患者在5年的隨訪中沒有出現轉移性復發。同樣，Lussier 等檢測也發現，多種miRNAs 可區分高進展組和低進展組患者，并預測轉移進展及生存情況。這些研究為今后miRNAs 用于寡轉移診斷與治療打下了基礎。

4 小結及展望

目前，研究發現在腫瘤寡轉移階段，不同miRNAs在腫瘤細胞增殖、遷移、黏附和EMT 上有相似的生物學效應。同時，多種miRNAs 可為寡轉移患者選擇合適治療手段并有效預測患者預后及生存情況。另外，對已發生寡轉移患者，及時放療或手術切除可能明顯改善預后。然而，與寡轉移理論不同，Halsted 等認為，腫瘤的擴散是有序地從原發腫瘤經淋巴管向遠處擴散，系統性假說認為，臨床顯著性腫瘤是一種全身性疾病。因此Halsted 理論認為根治性切除可以治愈腫瘤，而系統性理論只依賴于全身治療，且對局部轉移療效有限。不可否認，Halsted 等的理論與系統性理論都在腫瘤治療中發揮了一定作用，但與之相比，充分認識寡轉移并闡明其生物學機制有可能提供更精準的腫瘤診斷和治療。

雖然現有的研究仍有不足之處，但隨著研究的深入及上述問題的解決，miRNAs 在寡轉移中的突出作用將為未來的診斷與治療做出貢獻。