苦蕎酒中總黃酮含量的測定

安 軍

（海南椰島酒業發展有限公司，海南?？?570100）

苦蕎麥具有較高的營養價值，含有蛋白質、生物類黃酮、多種維生素、纖維素和18種氨基酸等多種成分。此外，它還是一味藥用價值較高的中藥?，F代醫學研究表明，苦蕎麥具有降血糖、降血脂、抗疲勞和增強免疫的功能，這都與其中所含的黃酮類化合物有關[1]。本文通過方法學相關系列實驗，采用分光光度法對苦蕎酒中的總黃酮含量進行檢測，為苦蕎酒中總黃酮的相關研究提供參考[2]。

1 材料與方法

1.1 儀器

電子天平XS205（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；紫外-可見分光光度計TU-1810（北京普析通用儀器有限責任公司）；超純水機MUL-9000（B）-1-10（南京總馨純水設備有限公司）；移液槍（200 μL、1000 μL、5 mL，上海寶予德科學儀器有限公司）；渦旋混勻儀ZX4（意大利VELP）； 超聲波清洗器KQ-300VDB（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 溶液配制

①40%乙醇溶液。量取40 mL無水乙醇，定容至100 mL，混勻。②5%亞硝酸鈉溶液。稱取5.0 g亞硝酸鈉，用水溶解，定容至100 mL，混勻。③10%硝酸鋁溶液。稱取10.0 g硝酸鋁，用水溶解，定容至100 mL，混勻。④4%氫氧化鈉溶液。稱取4.0 g氫氧化鈉，用水溶解，定容至100 mL，混勻。⑤200 mg/L 蘆丁標準溶液。準確稱取10.0 mg蘆丁標準品至 50 mL容量瓶中，加入40%乙醇溶液充分溶解后，定容、混勻。本方法中的水為GB/T 6682—2008規定的一級水。

1.3 測定方法

1.3.1 檢測波長的選擇

準確稱量蘆丁標準物質11.13 mg（100080-201811， 92.4%，中國食品藥品檢定研究院）于50 mL容量瓶中，用40%乙醇定容并搖勻。吸取蘆丁標準溶液1.0 mL置于10 mL具塞比色管中，加入0.3 mL5%亞硝酸鈉溶液并搖勻，靜置6 min，再加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min，加入4 mL 4%氫氧化鈉溶液，充分搖勻，用40%乙醇定容至刻度，搖勻靜置12 min，在波長400～600 nm下進行掃描，確定最佳吸收波長。

1.3.2 工作標準曲線的繪制

精確吸取蘆丁標準溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、 0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL，分別置于10 mL具塞比色管中，分別添加40%乙醇至1 mL，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液并搖勻，靜置6 min，再加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min，加入4 mL 4%氫氧化鈉溶液，充分搖勻，用40%乙醇定容至刻度，搖勻靜置12 min。于波長510 nm處測定吸光度值，同時以40%乙醇為空白測定吸光度。以吸光度為縱坐標，蘆丁質量為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.3 樣品的測定

準確吸取苦蕎酒樣品1.0 mL，置于10 mL比色管中，按照1.3.2中的方法，于波長510 nm處測定其吸光度值，并根據標準曲線計算出總黃酮含量。

1.3.4 總黃酮含量的計算

總黃酮含量的計算公式為

式中：C為苦蕎酒中總黃酮的含量，μg/mL；A為樣品吸光度；X為標準曲線截距；B為標準曲線斜率。

2 結果與分析

2.1 波長的確定

取蘆丁標準溶液1.0 mL，置于10 mL比色管中，按照1.3.2中的方法操作，最后搖勻靜置12 min。以試劑空白為參比，于400～600 nm波長下測定吸收曲線。結果表明蘆丁標準溶液在510 nm處有最大吸收，因此選擇510 nm作為測定波長。

2.2 顯色條件的優化

2.2.1 總黃酮在不同溶劑中吸收情況

取蘆丁標準溶液各1.0 mL于3個10 mL比色管中，按照1.3.2中的方法，最后搖勻靜置12 min。以試劑空白為參比，于波長510 nm處測定其吸光度值，詳見表1。結果表明，在相同實驗條件下總黃酮在40%乙醇溶劑中吸光度最大。

表1 不同試劑的吸光度情況

2.2.2 顯色劑硝酸鋁濃度的選擇

取蘆丁標準溶液各1.0 mL于5個10 mL比色管中，按照1.3.2中的方法，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液并搖勻，靜置6 min，再加入不同質量濃度（2%、5%、10%、15%和20%）硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加4 mL 4%氫氧化鈉溶液，充分搖勻，用40%乙醇定容至刻度，搖勻靜置12 min。以試劑空白為參比，于波長510 nm處測定其吸光度值，結果見表2。隨著硝酸鋁濃度的增加，吸光度快速增加，在濃度為10%時達到最大值，此后再增加濃度，吸光度值緩慢下降，因此選擇硝酸鋁濃度 為10%。

表2 不同硝酸鋁濃度吸光度情況

2.2.3 顯色劑硝酸鋁用量的選擇

取蘆丁標準溶液各1.0 mL于5個10 mL比色管中，按照1.3.2中的方法，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液并搖勻，靜置6 min，再加入不同體積（0.1 mL、 0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL和0.5 mL）10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min，加4 mL 4%氫氧化鈉溶液，充分搖勻，用40%乙醇定容至刻度，搖勻靜置12 min。以試劑空白為參比，于波長510 nm處測定其吸光度值。如表3所示，隨著硝酸鋁使用量的增加，吸光度值迅速增大，在加入量0.3 mL時到達最大值，此后再增大加入量，吸光度呈現下降趨勢并逐漸趨于穩定，因此選擇硝酸鋁用量為0.3 mL。

表3 不同硝酸鋁用量吸光度情況

2.3 工作標準曲線及線性范圍

按照1.3.2中的方法，得到回歸方程：Y=0.00133X+ 0.00121，其中斜率a=0.00133，截距b=0.00121，相關系數R=0.9999。由試驗結果可知，蘆丁在0～ 205.682 μg呈良好的線性關系，詳見表4。

表4 標準含量系列與相應的吸光度

2.4 檢出限與測定下限

根據《環境監測分析方法標準制訂技術導則》（HJ 168—2020）[3]的技術要求，結合回歸方程Y=0.00133X+0.00121，可計算出檢出限為7.5 μg，測定下限為30 μg。

2.5 精密度

選取兩種苦蕎酒樣品，每份各1.0 mL，按照1.3.2中的方法連續測定6次，詳見表5。結果顯示RSD值為3.54%，說明該方法精密度高。實驗過程中，發現兩種苦蕎酒經顯色劑顯色后，其絡合物顏色分別為淡紅色和橙黃色。

表5 精密度實驗測定結果

2.6 穩定性

取苦蕎酒樣品1.0 mL，按照1.3.2中的方法將樣品制備完成后，于不同時間測其吸光度，觀察2 h內吸光度變化趨勢（見表6）。結果表明，該方法在2 h內穩定性良好。

表6 穩定性試驗

2.7 重復性

由兩名實驗人員取兩種苦蕎酒樣品，每種6份各1.0 mL，按照1.3.2中的方法測定吸光度，并根據標準曲線計算出總黃酮含量（見表7）。結果表明，該方法重復性較好。

表7 樣品重復性試驗

2.8 加標回收率

取兩種苦蕎酒樣品，按照1.3.2中的方法進行加標回收率檢測，平行測定3次。實驗結果表明，該方法的回收率為88.88%～98.28%，滿足分析要求（見表8）。

表8 樣品回收率試驗

3 討論與結論

實驗過程中發現，蘆丁標準溶液、苦蕎酒經顯色劑顯色后，其絡合物顏色分別為淡紅色和橙黃色，是由于黃酮類化合物泛指這種兩個苯環通過中央三碳鏈相互連接而成的一系列化合物，而黃酮類化合物的顏色根據中間吡喃環的不同氧化水平和兩側A、B環上連接的各種取代基而分為不同的黃酮類型[4-5]。只有物質中含有鄰二酚羥基，并且鄰二酚羥基沒有取代基時，該法才在510 nm處有最大吸收。通過上述實驗可以得出，該方法能快速準確地檢測苦蕎酒中總黃酮的含量，操作簡單，其精密度、重復性和加標回收率等各項指標均符合相關標準的分析檢測要求，結果準確可靠。