吐根堿結合PARP-1逆轉肝癌細胞HepG2/DDP耐藥的作用研究

任鵬飛，劉 晨，冉 翔，王恒毅

作者單位：1安徽醫科大學第一附屬醫院普外科，合肥 2300322安徽醫科大學附屬阜陽醫院急診科，阜陽 2360003安徽醫科大學藥學院，合肥 230032

肝癌是惡性程度最大的腫瘤之一。化療耐藥是肝癌患者預后差的重要原因[1]。鉑類藥物是肝癌治療的一線藥物，但長期使用往往會出現耐藥性[2]。DNA損傷修復是導致肝癌耐藥最主要的機制[3-4]。研究[5-6]表明，DNA修復酶多聚 (ADP-核糖) 聚合酶-1[poly (ADP-ribose) polymerase-1, PARP-1]在耐藥肝癌細胞中高度表達, 在臨床上顯著降低鉑類藥物對肝癌的治療作用。吐根堿是一種異喹啉生物堿，近年來研究[7-8]發現吐根堿聯合化療藥物能夠增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，但是機制尚不明確。因此，該研究構建了順鉑(cisplatin, DDP)耐藥肝癌細胞株HepG2/DDP，評價吐根堿是否通過結合PARP-1而發揮增敏順鉑的抗腫瘤作用，希望為臨床逆轉肝癌耐藥的研究提供一定的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料吐根堿(貨號：E275439)、瑞卡帕布(貨號：R288628)、DDP(貨號：C295225)、3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑鎓溴化物(MTT，貨號：T100896)購自上海阿拉丁試劑有限公司；PARP-1購自美國Sigma-Aldrich 公司?？筆AR抗體、抗γH2AX抗體、抗PARP-1抗體、抗β-actin抗體、抗BAX抗體、抗Bcl2抗體、抗Caspase-3抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；PARP-1 siRNA、NC siRNA購自廣州市銳博生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；HepG2細胞來源于安徽醫科大學藥學院細胞存儲中心。

1.2 反向虛擬篩選與分子對接采用Discovery studio 2017軟件進行反向篩選和分子對接。用Chemdraw 2010繪制吐根堿結構，Discovery studio 2017優化加氫，Libdock程序與Discovery studio 2017軟件蛋白數據庫組件對接，選取排名前十的蛋白進行分析，選擇目標蛋白，再次利用Libdock程序與目標蛋白進行對接，獲得三維(合)二維結合模式圖，分析小分子與配體間的鍵合作用。蛋白質晶體結構來源于Protein Data Bank數據庫。

1.3 表面等離子體共振實驗將PARP-1蛋白標記在芯片上，6種濃度的吐根堿(500、250、125、62.5、31.25、15.625 nmol/L)通過6個通道以20 μl/min 的速度流過芯片，持續5 min，再用磷酸鹽緩沖液沖洗10 min，Biacore T200 2.1軟件分析結果，實驗采用GE Biacore T200 生物大分子相互作用分析儀(Cytiva，美國)進行操作。

1.4 DDP耐藥細胞HepG2/DDP的構建采用藥物大劑量沖擊和低劑量持續誘導相結合的方法誘導細胞產生耐藥性。將HepG2細胞置于含有10%胎牛血清、100 U/ml青-鏈雙抗的DMEM培養基中培養，待HepG2細胞細胞融合度超過60%以后加入5 g/ml的DDP培養，24 h后洗去死細胞，繼續培養，待再次融合度超過60%后加入5 g/ml的DDP培養，24 h后洗去死細胞，依次反復傳代10次。隨后將得到的細胞加入0.5 g/ml的DDP適應性培養，培養10代之后檢測DDP的IC50，檢測細胞的耐藥性，備用，并將細胞命名為HepG2/DDP。

1.5 細胞毒實驗將處于對數生長期的HepG2或HepG2/DDP接種到96孔板中(密度為5 000個細胞/孔)。培養24 h后加入DDP(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg/ml)或吐根堿(1、2、4、8、16、32、64 μmol/L)或吐根堿(16 μmol/L)+DDP(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg/ml)后繼續培養24 h，吸去培養基后每孔加入20 μl濃度為5 mg/ml的MTT，在37℃ 繼續孵育4 h，每孔再加入100 μl DMSO，混勻，在490 nm波長處檢測吸光度，所有實驗重復3次，計算細胞生存率、IC50值及HepG2/DDP細胞的耐藥指數(RI)。RI=耐藥株IC50/非耐藥株IC50。

1.6 轉染實驗siRNA由廣州市銳博生物科技有限公司合成。PARP-1 siRNA序列為5′-GGAUGAUCUUCGACGUGGA-3′；陰性對照NC siRNA序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′。根據LipofectamineTM 2000說明書進行轉染。轉染后進行免疫熒光實驗、蛋白印跡實驗及細胞毒實驗(設為空白組、4 μg/ml DDP組、16 μmol/L吐根堿+4 μg/ml DDP組)。

1.7 免疫熒光實驗取轉染后的細胞，加入到24孔板中預包被多聚賴氨酸的玻片上，37℃孵育5 h，待貼壁后吸干液體，多聚甲醛固定，30 min后加入羊血清封閉，孵育40 min，吸棄液體加入一抗后4℃孵育過夜，PBS洗滌3次，加入二抗進行熒光染色，作用1 h后用熒光顯微鏡下觀察結果。

1.8 蛋白印跡實驗將濃度分別為0、4、8、16 μmol/L的吐根堿與HepG2/DDP細胞孵育24 h或單獨培養HepG2、HepG2/DDP和HepG2/DDP (PARP-1 siRNA) 細胞24 h后收集細胞，蛋白定量后SDS-PAGE電泳分離蛋白轉膜，用TBS-T配制的含5%脫脂牛奶的緩沖液封閉，1 h后用TBS-T 緩沖液洗膜3 次，加入1 ∶1 000 稀釋比例的一抗(抗PAR抗體、抗γH2AX抗體、抗PARP-1抗體、抗BAX抗體、抗Bcl2抗體、抗Cleaved-caspase-3抗體、抗β-actin抗體), 4℃孵育過夜。過夜后待膜恢復至室溫，TBS-T緩沖液洗膜3次，加入1 ∶3 000稀釋的對應二抗，孵育1 h，取出膜后TBS-T 緩沖液洗膜3次，吸干，加入化學發光劑進行凝膠成像檢測，計算吸光度，分析結果。

1.9 流式細胞檢測將對數生長期的HepG2/DDP細胞調整濃度為1×105個/ml，接種到6孔板中。分別設空白組、DDP組(4 g/ml)和吐根堿(16 μmol/L)+DDP(4 g/ml)組，培養24 h后收集細胞，1 000 r/min、4 ℃下離心5 min，并用預冷PBS沖洗兩次。隨后將細胞重新懸浮在100 μl PBS緩沖液中，加入5 μl Annexin V-FITC混合。冰上避光15 min，然后添加400 μl PBS。流式細胞儀檢測前加入5 μl碘化丙碇溶液，混勻后快速檢測細胞凋亡率。

2 結果

2.1 吐根堿體外與PARP-1的相互作用反向虛擬篩選結果顯示吐根堿對多個藥物靶點有良好的結合作用。取契合值打分排名前十的靶點分析顯示，吐根堿與降低化療藥物敏感性相關的DNA修復酶PARP-1 (PDB ID: 4und)有較高的契合值打分，提示吐根堿可能通過結合PARP-1增強化療藥物的敏感性。見表1。

表1 Discovery Studio 2017預測的排名前十位的蛋白質晶體靶標

對已報道的PARP-1的活性位點進行對接，結果顯示吐根堿能夠通過多種模式結合到PARP-1活性位點中，包括：一個形成于氨基酸GLY863和異喹啉環上的羥基的氫鍵；一個形成于氨基酸GLU988和異喹啉環上質子化N的離子鍵；芳香族氨基酸TYR806、TYR889、TYR907分別與吐根堿結構中的苯環產生的π-π堆積作用；多個疏水氨基酸與吐根堿通過范德華力和和多個弱的碳氫鍵相互作用。見圖1。

SPR實驗在分子水平觀察吐根堿與PARP-1的相互作用，采用瑞卡帕布作為陽性對照。結果如圖2所示，各種濃度(化合物濃度依次為500、250、125、62.5、31.25、15.625 nmol/L)的吐根堿和瑞卡帕布通過標記PARP-1蛋白的芯片后，芯片表面偏振光折射率發生不同程度的變化，表明小分子與PARP-1蛋白發生結合作用。對結合曲線進行擬合的到解離動力學常數KD值，兩者分別為5.73×10-6mol/L(吐根堿)和4.26×10-6mol/L(瑞卡帕布)，說明吐根堿與PARP-1有良好的結合作用。

2.2 HepG2/DDP細胞耐藥性鑒定及PARP-1的表達分析MTT法檢測了DDP對HepG2和HepG2/DDP耐藥株的IC50值。結果如圖3A所示，DDP對HepG2細胞增殖有顯著的抑制作用，各組間差異有統計學意義(F=61.14,P<0.01)，IC50值為(4.27±0.34) μg/ml；HepG2/DDP細胞株對各個濃度的DDP均顯示出一定的耐藥性(F=73.96,P<0.01)，IC50值增至(15.76±0.84) μg/ml，RI值為3.69。這一結果說明HepG2/DDP細胞對DDP產生了顯著的耐藥性。蛋白印跡實驗顯示 (圖3B、C)，PARP-1在HepG2/DDP細胞中的表達量較HepG2顯著提高，差異有統計學意義(t=13.68,P<0.01)。

2.3 吐根堿對HepG2/DDP細胞耐藥性的逆轉分析如圖4A所示，吐根堿在1～16 μmol/L濃度區間內對HepG2/DDP細胞的增殖無明顯抑制作用，當濃度達到32 μmol/L時，HepG2/DDP細胞的增殖顯著受到抑制，抑制率達到(21.86±1.78) %，故選擇16 μmol/L作為吐根堿的無毒閾值研究其對HepG2/DDP細胞的增敏作用。進一步研究顯示吐根堿(16 μmol/L)聯合不同濃度DDP與HepG2/DDP細胞共培養后，細胞生存率較DDP單用組下降，差異有統計學意義(F=98.49,P<0.01)。計算吐根堿和DDP聯合用藥的IC50值，結果顯示較DDP單獨使用組，IC50值顯著下降[IC50值為(3.95 ±0.43) g/ml]，RI值為0.93。這一結果提示吐根堿對HepG2/DDP細胞DDP的耐藥性有顯著的逆轉作用。見圖4B。

圖1 吐根堿與PARP-1(PDB號：4und)的結合模式圖

圖2 SPR檢測吐根堿與PARP-1結合作用

圖3 HepG2/DDP細胞耐藥性鑒定及細胞株中PARP-1的表達

2.4 吐根堿在細胞內對PARP-1酶活性的影響為進一步評價吐根堿對PARP-1的抑制作用，采用免疫印跡法檢測了細胞內反映PARP-1 酶活性PAR表達水平及反映DNA 損傷的γH2AX表達水平。結果顯示，吐根堿處理HepG2/DDP細胞24 h后，細胞內PAR的表達量明顯降低，γH2AX的表達量增加(FPAR=519.0,P<0.01；FH2AX=794.3,P<0.01)，提示吐根堿可抑制HepG2/DDP細胞中的 PARP-1活性，進而阻斷細胞內 DNA 損傷修復，增強化療藥物對腫瘤細胞的敏感性。見圖5。

2.5 吐根堿聯合DDP對沉默PARP-1 的HEPG2/DDP細胞增殖的影響如圖6所示，免疫熒光和蛋白印跡實驗顯示PARP-1 siRNA轉染后HEPG2/DDP細胞中的PARP-1生成量顯著降低；在吐根堿存在的條件下，與陰性對照組相比，DDP對PARP-1 siRNA轉染的HEPG2/DDP細胞的增殖沒有明顯的影響。這一結果進一步證實了吐根堿通過抑制腫瘤細胞中的 PARP1活性，增強化療藥物的敏感性。

2.6 吐根堿聯合DDP對HepG2/DDP細胞凋亡的影響結果如圖7所示，空白組、DDP組和吐根堿+DDP組細胞凋亡率分別為(2.84±1.02)%、(11.87±2.41)%和(39.77±4.66)%。與DDP組比較，吐根堿+DDP組HepG2/DDP細胞凋亡率顯著升高，差異有統計學差異(t=11.22,P<0.01)。蛋白印跡實驗顯示(圖7B、C)，DDP降低Bcl2表達，同時增加BAX和切割的Caspase-3的表達水平，吐根堿則顯著增強了DDP調控這些凋亡相關蛋白的作用，差異有統計學差異(F=84.27,P<0.01)。

圖4 吐根堿對HepG2/DDP細胞耐藥性的逆轉作用

圖5 吐根堿在細胞內對PARP-1酶活性的影響

圖6 吐根堿聯合DDP對沉默PARP-1的HEPG2/DDP細胞增殖的影響

3 討論

化療耐藥是導致肝癌綜合治療失敗、病死率居高不下的一個主要因素。因此，研究肝癌的化療耐藥機制，尋找逆轉化療耐藥的方法顯得尤為重要。腫瘤細胞中PARP1 蛋白響應于 DNA 損傷反應，在被 DNA 鏈斷裂激活后，PARP1 以 NAD+依賴性方式催化PAR的合成，進行DNA損傷修復，這一過程在幾秒鐘內即可發生，是最快的 DNA 損傷反應之一[3-4]。近年來，多種結構的PARP-1抑制劑陸續被開發出來，其中一些抑制劑目前作為單一藥物或與DNA損傷藥物聯合已進入臨床試驗的不同階段[9-10]。目前已有2 個PARP-1抑制劑獲批上市，包括奧拉帕瑞布和拉卡帕瑞[11]。多項研究[12]表明，這些PAPR-1抑制劑能提高肝癌細胞對DNA損傷藥物敏感性，但是部分藥物仍然存在如藥代動力學差、潛在毒性的缺陷。因此，仍然需要努力尋找具高效低毒的新型骨架的PARP-1抑制劑。

天然產物是新藥發現的巨大寶庫，本研究顯示來源于天然產物茜草科植物吐根單體成分吐根堿具有潛在的增敏DDP對肝癌細胞HEPG2/DDP的毒性作用，這一結果提示在臨床治療中吐根堿具有成為化療藥物增敏劑的潛力。計算機反向虛擬篩選的過程表明吐根堿與PARP-1有良好的結合作用，提示吐根堿可能是通過結合PARP-1、抑制PARP-1活性而發揮增敏化療藥物的作用。分子對接實驗分析了吐根堿與PARP-1的結合模式，顯示吐根堿能通過多重作用與PARP-1的活性位點的多個氨基酸殘基鍵合，在這些氨基酸中，GLY 863和TYR 907已被證實是PARP-1抑制劑鍵合的關鍵氨基酸[13]。SPR實驗在體外分析了吐根堿與PARP-1的相互作用，結果顯示其結合PARP-1的能力與陽性藥物瑞卡帕布相當。在細胞水平上，免疫印跡實驗顯示吐根堿可顯著抑制PARP-1的活性，表現為抑制酶活標志物PAR表達，增強DNA損傷標志物γH2AX的表達。此外，siRNA轉染實驗評價了沉默PARP-1基因后吐根堿聯合DDP對的HEPG2/DDP細胞增殖的影響。結果顯示沉默PARP-1基因的HEPG2/DDP細胞聯合使用吐根堿的DDP與單獨使用DDP相比,病死率沒有明顯變化，進一步證實了吐根堿對DDP的增敏作用是通過靶向結合PARP-1。

圖7 吐根堿(16 μmol/L)聯合DDP(4 μg/ml)對HepG2/DDP細胞凋亡的影響

與DNA發生烷基化反應，損傷腫瘤細胞DNA是鉑類藥物誘導腫瘤細胞凋亡的主要機制[14]。PARP-1與凋亡蛋白P53關系密切，其不僅參與P53蛋白活化途徑，而且能夠促進P53與細胞內損傷DNA缺口相結合，進而修復鉑類藥物導致的DNA損傷[15]。因此，PARP-1作為DNA修復酶，阻礙其激活對鉑類藥物誘導腫瘤細胞凋亡非常重要。在本研究中，Annexinv-PI雙染實驗結果顯示，與DDP單獨使用組相比，吐根堿可顯著增加DDP誘導的HepG2/DDP細胞后期凋亡，凋亡相關蛋白Bcl2表達顯著降低，Bax、Caspase-3的表達明顯增加。結合先前實驗結果，進一步表明吐根堿可以通過抑制PARP-1活性，增強HepG2/DDP細胞對DDP敏感性，促進DDP誘導腫瘤細胞的凋亡。

綜上所述, 本研究表明吐根堿對DNA修復酶PARP-1具有較強的抑制作用，能夠增強鉑類化療藥物對耐藥肝癌細胞株的敏感性，為進一步開發治療腫瘤的新型PARP-1 抑制劑提供了基礎。本研究尚存在著一些不足，如選取的腫瘤細胞種類單一、未開展動物體內實驗、化合物藥代動力學信息不足等，后續的研究將針對這些缺陷開展工作以提供更多吐根堿作為腫瘤治療藥物先導化合物的數據。