豬DNA甲基轉移酶基因家族進化分析

龔文滔，潘向春，蔡佳麗，王祎菲，李加琪，張 哲，袁曉龍

(1.華南農業大學動物科學學院，廣東省農業動物基因組學與分子育種重點實驗室，國家生豬種業工程技術研究中心，廣州 510642；2.嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室茂名分中心，茂名 525000)

表觀遺傳學是指基因活性或功能的可遺傳變化現象，與DNA序列本身的變化無關。作為研究最廣泛的表觀遺傳機制之一，DNA甲基化是一種不改變DNA序列順序的堿基修飾[1]，且廣泛參與哺乳動物多種生物學進程，包括轉錄活性調節[2-3]、X染色體失活[2]、基因組印跡[2,4]和染色體穩定性[4]。在哺乳動物中，DNA甲基化主要發生在CpG位點的胞嘧啶上，并在細胞分裂過程中被穩定遺傳[5]，而DNA甲基化的發生離不開甲基轉移酶(DNMT)的催化作用。DNMT可將甲基從S-腺苷-L-甲硫氨酸轉移到胞嘧啶的第5個碳原子上，從而形成甲基化胞嘧啶[6]。目前哺乳動物中主要發現4種類型的DNMT，分別為DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L[7]。DNMT1主要用于維持基因組的DNA甲基化狀態；DNMT3A和DNMT3B具有從頭甲基化的功能，即對非甲基化的DNA進行甲基化修飾；DNMT3L可增強DNMT3A和DNMT3B的催化活性，促進DNA的從頭甲基化過程[8-9]。

DNMT參與哺乳動物的生長發育和疾病等多種生物學活動。有研究表明，敲除DNMT1或DNMT3B后，小鼠在妊娠期中死亡，而敲除DNMT3A后，小鼠在出生后4周齡死亡[10]。Liao等[11]使用CRISPR/Cas9基因組編輯技術敲除人類胚胎干細胞中的DNA甲基化轉移酶，結果發現DNMT1的缺失導致人類胚胎干細胞的快速死亡。此外，DNMT1、DNMT3A和DNMT3B在轉錄和翻譯水平上的過表達會降低抑癌基因的表達水平，從而導致惡性腫瘤的發生，如結腸癌、肺癌、膠質母細胞瘤、血液系統惡性腫瘤、前列腺癌和乳腺癌[12]。Rhee等[13]表明，同時抑制DNMT1和DNMT3B的表達可使結直腸癌模型中的抑癌基因整體低甲基化并被重新激活，進而導致腫瘤細胞增殖減少。以上結果表明，DNMT廣泛參與哺乳動物生物學活動的調控過程。

目前，關于豬DNMT基因家族的系統研究鮮見報道。本研究以豬為研究對象，利用生物信息學方法鑒定豬全基因組范圍的DNMT基因家族，并對豬DNMT基因家族成員進行染色體定位、理化性質、二級結構預測、亞細胞定位、基因結構、保守基序、系統進化和種間共線性分析，探討DNMT基因家族在母豬性腺軸初情啟動過程前、中、后的基因表達水平，旨在為進一步探究豬DNMT基因家族功能與調節機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 豬DNMT基因家族的鑒定和染色體定位分析

從Ensembl數據庫(https:∥asia.ensembl.org/info/data/ftp/index.html)中下載豬的全基因組序列文件、基因注釋文件、蛋白質序列文件。從Pfam網站(https:∥pfam.xfam.org/)下載DNMT家族的隱馬爾科夫模型(HMM)文件(PF00145)，利用Hammer軟件中的hmmsearch程序搜索豬蛋白質序列文件，進而鑒定DNMT基因家族成員。基于Hammer軟件的鑒定結果，利用BLASTP程序進行第2次DNMT基因家族鑒定。將Hammer軟件和BLASTP程序的鑒定結果合并，得到候選DNMT基因家族成員。通過CDD網站(https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ bwr psb/bwrpsb.cgi)進行保守結構域分析，剔除候選DNMT基因家族成員中不含DNMT特征結構域的序列，最終得到豬DNMT家族成員。從基因注釋文件中獲得豬DNMT基因的位置信息，并通過TBtools[14]繪制豬DNMT基因的染色體定位圖。

1.2 基因結構和保守基序分析

基于基因注釋文件，使用TBtools展示DNMT基因家族成員的UTR及內含子信息。通過MEME網站(https:∥meme-suite.org/meme/tools/meme)對DNMT基因家族成員進行保守基序(motif)分析，其中motif數量設置為10個，其余參數選擇默認，最后通過TBtools得到可視化圖形。

1.3 系統進化樹和種間共線性分析

從Ensembl數據庫中下載人、小鼠和牛的全基因組序列文件、基因注釋文件、蛋白質序列文件，然后使用Hammer軟件和BLASTP軟件初步鑒定人、小鼠和牛的DNMT基因家族成員，再通過CDD網站進行保守結構域分析，以獲得人、小鼠和牛的DNMT基因家族成員。使用Mega 10.1.7軟件對豬、人、小鼠和牛的DNMT蛋白質序列進行多重比對，并基于距離參數的鄰接法構建系統進化樹，設自展值為1 000，其他參數則按默認設置。基于豬、人、小鼠和牛的基因序列文件和基因注釋文件，使用TBtools的One Step MCScanX功能進行物種間的共線性分析，并使用TBtools的Dual Systeny Plot for MCScanX功能進行可視化。

1.4 蛋白理化性質、二級結構預測和亞細胞定位分析

利用ExPASy在線工具(https:∥web.expasy.org/compute_pi/)分析豬DNMT基因家族成員的蛋白質特性，預測蛋白質的分子質量和等電點；利用SOPMA在線工具(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page =npsa_sopma.html)預測DNMT蛋白的二級結構；利用PSORT在線工具(https:∥wolfpsort.hgc.jp/)進行DNMT蛋白的亞細胞定位分析。

1.5 豬DNMT基因家族成員的表達分析

從NCBI數據庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲取母豬下丘腦、垂體、卵巢的RNA-Seq數據(登錄號：PRJEB39729)[15]，其中每種組織都包含初情啟動前、初情啟動、初情啟動后的轉錄組數據，共下載27個轉錄組數據。對轉錄組數據進行質控后，利用HISAT2軟件[16]將轉錄組數據比對到參考基因組，隨后利用Stringtie軟件[17]估計基因的表達量，以基因最長轉錄本的表達量作為該基因的表達水平，從而獲得DNMT基因家族所有成員的表達水平。根據DNMT基因表達量的TPM值，利用R語言繪制出基因表達熱圖。

2 結 果

2.1 豬DNMT基因家族鑒定和染色體定位分析

利用Hmmer軟件和BLASTP軟件從豬基因組上共鑒定出5個DNMT基因家族成員，并將其命名為PigDNMT1、PigDNMT2、PigDNMT3、PigDNMT4和PigDNMT5，其長度介于13 726～80 213 bp，其中3個基因位于參考基因組的正鏈，2個基因位于參考基因組的負鏈(表1)。由圖1可知，PigDNMT1、PigDNMT2、PigDNMT3、PigDNMT4和PigDNMT5基因分別位于2、3、13、14、17號染色體上，每條染色體都只包含1個DNMT基因。

2.2 豬DNMT基因序列結構分析

通過MEME在線工具進行保守基序分析，結果如圖2所示，PigDNMT1和PigDNMT2僅包含1個motif，PigDNMT3包含6個motif，而PigDNMT2和PigDNMT5包含10個相同的motif且排列順序一致。基因結構分析結果顯示，大部分DNMT基因含有多個CDS區域，僅PigDNMT4含有2個CDS區域；此外，還發現PigDNMT1、PigDNMT3和PigDNMT5缺少3′-UTR(圖2)。從豬DNMT基因家族進化樹的角度分析發現，PigDNMT1和PigDNMT4、PigDNMT2和PigDNMT5的親緣關系較近(圖2)。整體而言，同一分支上的DNMT基因在motif數量上相似，但在基因結構上差異較大。

圖2 豬DNMT基因家族結構特征

2.3 DNMT基因的系統進化分析

本研究使用Hammer和BLASTP軟件在人、小鼠、牛中分別鑒定出6、7、5個DNMT基因(表2)，并結合5個豬DNMT基因構建系統進化樹，結果如圖3所示，23個DNMT基因可分成Class Ⅰ、Class Ⅱ和Class Ⅲ 3個亞族，其中Class Ⅰ亞族可被進一步細分為Class Ⅰ-a和Class Ⅰ-b亞族。在4個亞族中，Class Ⅰ-a亞族的DNMT基因數量最多，共有14個DNMT基因，其中包含PigDNMT1、PigDNMT3和PigDNMT4；Class Ⅰ-b共有5個DNMT基因，其中包含PigDNMT5；Class Ⅱ亞族共有3個DNMT基因，其中包含PigDNMT2；而Class Ⅲ亞族的DNMT基因數量最少，僅包含CattleDNMT5。此外，根據豬與人、小鼠、牛的進化關系發現，豬與牛的DNMT基因家族親緣關系更近。

表2 人、小鼠和牛DNMT基因家族成員基本信息

圖3 豬、人、小鼠和牛DNMT基因家族的系統進化樹

2.4 DNMT基因的共線性分析

為了進一步了解豬DNMT基因家族的進化關系，使用TBtools的One Step MCScanX功能對豬、人、小鼠和牛中DNMT基因家族進行物種間的共線性分析。如圖4所示，豬和人、小鼠、牛之間具有4對直系同源DNMT基因，其中PigDNMT1、PigDNMT2、PigDNMT3、PigDNMT4都能在人、小鼠和牛中鑒定到相應的直系同源基因，只有PigDNMT5無法在其他3個物種中檢測出直系同源基因。

圖4 豬、人、小鼠和牛DNMT基因家族的共線性分析

2.5 豬DNMT蛋白的理化性質、二級結構預測及亞細胞定位

豬DNMT基因家族成員的蛋白長度在228(PigDNMT4)～1 706 個氨基酸(PigDNMT1)之間；分子質量介于26 133.32(PigDNMT4)～192 267.80 u(PigDNMT1)之間；而蛋白等電點最小為6.00(PigDNMT3)，最大為9.06(PigDNMT4)，其中2個DNMT蛋白呈酸性(等電點<7)，3個DNMT蛋白呈堿性(等電點>7)(表3)。二級結構預測結果顯示，豬DNMT基因家族蛋白的二級結構主要由無規則卷曲組成，隨后依次為α-螺旋、β-轉角、延伸鏈。亞細胞定位分析發現，豬DNMT基因家族蛋白全部定位于細胞核中(表4)。

表3 豬DNMT蛋白的理化性質

表4 豬DNMT蛋白的二級結構預測和亞細胞定位

2.6 不同發育時期豬DNMT基因家族的表達變化

對豬性腺軸初情啟動前、初情啟動、初情啟動后的轉錄組數據進行分析，結果如圖5所示，PigDNMT2、PigDNMT3、PigDNMT4和PigDNMT5基因在性腺軸初情啟動過程中都處于低表達狀態，而PigDNMT1表達量明顯高于其他4個基因，且在初情啟動過程的不同組織中發生不同的變化。在初情啟動過程的下丘腦組織中，PigDNMT1基因表達量先升高后降低；在初情啟動過程的垂體組織中，PigDNMT1基因表達量逐漸升高；在初情啟動過程的卵巢組織中，PigDNMT1基因表達量逐漸下降。

H，下丘腦；P，垂體；O，卵巢；Pre，初情期啟動前；In，初情期啟動中；Post，初情期啟動后

3 討 論

在豬生長發育過程中，DNMT可能通過影響DNA甲基化狀態和形成過程而參與多種生物學機制，但是在豬中對于DNMT基因家族的系統分析還不全面。本研究利用生物信息學方法在豬基因組上共鑒定出5個DNMT基因，基因數目低于人(6個)和小鼠(7個)，而與牛(5個)一致，這可能與基因組的大小及基因的丟失和保留事件有關[18]。豬DNMT基因家族進化樹和保守基序分析發現，PigDNMT2和PigDNMT5的親緣關系較近，且具有相同數量和排列順序的motif，說明這2個基因在進化過程中具有較高保守性，推測PigDNMT2和PigDNMT5可能具有相似的基因功能。從基因結構的整體而言，豬DNMT基因家族成員之間的基因結構差異較大，如基因長度(13 726～80 213 bp)和CDS區長度(1 137～5 081 bp)，這與雞NLRs基因家族和杜蘭落花生球蛋白基因家族的基因結構分析結果一致[19-20]。另有研究表明，各成員間基因結構的差異可能與基因進化過程中出現重復、插入和缺失等突變現象有關[21]。基因共線性分析發現，豬和人、小鼠、牛之間都具有4對直系同源DNMT基因，說明4個物種之間具有較強的共線性關系，而從4個物種的系統進化樹分析結果中可以看出，豬與牛的DNMT基因家族親緣關系更近。亞細胞定位分析結果顯示，5個豬DNMT蛋白處于細胞核中。彭忠明等[22]也在毛竹中發現7個DNMT蛋白定位于細胞核中，這些結果表明DNMT可能是在細胞核內參與生物學進程。

基因表達模式與其生物學功能高度相關。本研究揭示了母豬性腺軸組織中DNMT基因家族在初情啟動前、初情啟動、初情啟動后中的表達模式，結果表明PigDNMT1表達量在下丘腦、垂體和卵巢組織中隨著初情啟動過程而發生不同的變化，如垂體組織中的PigDNMT1表達量在初情啟動過程中逐漸上升，而卵巢組織中的PigDNMT1表達量在初情啟動過程中逐漸下降。性腺軸可通過調節激素分泌驅動雌性動物的初情啟動[23-24]，進一步說明PigDNMT1可能在母豬初情啟動過程中發揮重要的調控作用，這與前人關于DNMT基因可能通過調控促性腺激素釋放激素(GnRH)的表達而參與母羊初情啟動的調控相符合[25]。另外有研究表明，DNA甲基化參與哺乳動物初情啟動的調控過程[26-27]。Lomniczi等[26]給大鼠注射DNA甲基化抑制劑之后，大鼠下丘腦中的胚胎外胚層發育(Eed)基因和染色盒同源物7(Cbx7)基因的表達水平上升，啟動子的甲基化水平下降，并且大鼠的陰道開放延遲，未達到初情期，表明DNA甲基化在大腦的神經內分泌中起作用，通過抑制初情期啟動所需的基因(如吻素1(Kiss1)基因)控制青春期。Zhou等[27]研究發現，DNA甲基化可通過調節R-脊椎蛋白2(RSPO2)的表達水平影響卵泡發育進而影響母豬的初情啟動。綜合以上結果及DNMT在DNA甲基化狀態和形成過程中的作用，說明豬DNMT基因家族中的PigDNMT1可能通過影響性腺軸關鍵基因的DNA甲基化參與母豬初情啟動的調控過程，這對于母豬初情啟動調控機制研究具有重要的參考價值，但PigDNMT1在母豬初情啟動過程中的作用機制需要進一步研究和分析。

4 結 論

本研究利用生物信息學方法在豬基因組上共鑒定出5個DNMT基因，并發現PigDNMT2和PigDNMT5在進化過程中具有較高保守性。共線性和進化樹分析結果表明，豬、人、小鼠和牛的DNMT基因間存在較強的共線性關系，但豬與牛的DNMT基因家族親緣關系更近。此外，性腺軸組織中的PigDNMT1在初情啟動過程中呈現出不同的表達模式。本研究可為深入解析豬DNMT基因家族功能提供一些參考。