豬SGK家族基因的生物信息學(xué)分析及其在豬脂肪組織和細胞中的表達

陳川河，劉嘉莉，張立蘭，趙 瑩，陶 聰，2

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東實驗室，廣州 510642)

豬的脂肪沉積是復(fù)雜的經(jīng)濟性狀之一，可通過調(diào)節(jié)機體能量平衡而顯著影響豬的瘦肉率、飼料轉(zhuǎn)化率和肉品質(zhì)。傳統(tǒng)的育種方法、分子育種和DNA分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)對豬背膘厚和瘦肉率的遺傳改良均取得了很大進展。目前雖已鑒定出一些與脂肪沉積相關(guān)的基因，如黑素皮質(zhì)素受體(MC4R)[1]、蘋果酸酶(ME1)[2]、瘦素受體(LEPR)[3]、胰島素樣生長因子2(IGF2)[4]、解偶聯(lián)蛋白1(UCP1)[5]、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)[6]、脂聯(lián)素(ADIPOQ)[7]、肌肉生長抑制素(MSTN)[8]、UCP3[9]等，但對影響豬脂肪沉積的基因挖掘還遠遠不足。哺乳動物的脂肪組織主要有存儲能量的白色脂肪組織(WAT)、與非戰(zhàn)栗產(chǎn)熱密切相關(guān)的棕色脂肪組織(BAT)以及由WAT在一定的刺激條件下生成的米色脂肪組織。棕色、米色脂肪能夠通過產(chǎn)熱消耗能量，已成為人類減肥相關(guān)研究的熱門靶點，也為降低豬的脂肪沉積提供了新的視角和思路。

血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型激酶(SGKs)是絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，包括SGK1、SGK2、SGK3 3個亞型。3種激酶均為離子通道活性、運輸和轉(zhuǎn)錄的有效調(diào)節(jié)劑[10-12]。SGK1與SGK2均可調(diào)節(jié)膜蛋白的功能，如Na+/H+交換劑[13]，有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白[14-15]和腎臟近端腎小管細胞中的Na+通道[16-20]。SGK1或SGK3基因敲除小鼠均未觀察到明顯的表型[20-21]，表明SGK1和SGK3均不是生存所必需的。研究表明，SGK1在脂肪組織中表達，通過磷酸化影響其亞細胞定位，抑制轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白O1(FOXO1)的表達，激活脂肪細胞中PPARγ的表達，從而促進脂肪細胞的生成[22-24]。在小鼠體內(nèi)，Herms等[25]將SGK2基因鑒定為在BAT中選擇性表達的基因。SGK2基因在冷刺激的小鼠BAT中表達水平顯著升高，在WAT中無顯著差異[26]。在藏豬冷刺激后的腹股溝WAT中以及藏豬基質(zhì)血管成分細胞(SVF)體外分化得到的米色脂肪細胞中均檢測到SGK2基因高表達[27]。以上證據(jù)表明SGK2可能參與哺乳動物BAT發(fā)育及其產(chǎn)熱功能，但是Park等[28]研究表明，SGK2基因全身性敲除小鼠體重?zé)o顯著變化，且小鼠在4 ℃冷刺激后體溫正常，β-3腎上腺素受體激動劑刺激后能量代謝正常，表明SGK2不直接參與小鼠棕色/米色脂肪的產(chǎn)熱。目前，關(guān)于SGK2在米色脂肪發(fā)育及脂肪沉積中的功能意義還不清晰，尚沒有關(guān)于豬SGK家族基因序列信息和功能的研究報道，特別是在豬脂肪形成過程中SGK家族基因的表達分析鮮見報道。7日齡豬腹股溝脂肪處于早期發(fā)育階段，脂肪發(fā)育較旺盛；4月齡仔豬腹股溝脂肪趨于成熟，屬于發(fā)育的晚期階段。本研究以豬SVF細胞為試驗材料，擴增SGK家族基因序列，運用生物信息學(xué)軟件預(yù)測基因功能，并通過實時熒光定量PCR技術(shù)研究SGK家族基因在脂肪組織和細胞中的表達水平，為研究SGK家族基因的調(diào)控功能、改善豬脂肪沉積提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 30日齡健康的巴馬豬和藏豬各10頭，分別購自廣西瑤族自治縣豬場和西藏林芝地區(qū)豬場。屠宰30日齡巴馬豬，收集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、不同部位肌肉和脂肪組織；屠宰7日齡和4月齡巴馬豬，收集腹股溝脂肪組織，用液氮快速冷凍后―80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ?0日齡藏豬腹股溝脂肪分離獲得藏豬SVF細胞。

1.1.2 主要試劑及儀器 TRIzol購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR試劑盒均購自TaKaRa公司；KOD FX、2×PCR Buffer for KOD FX、dNTPs均購自東洋紡(上海)生物科技有限公司；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基均購自Gibco公司。冷凍離心機(5810R)購自Eppendorf公司；電泳儀(DYY-6B)購自北京六一儀器廠；超微量紫外分光光度計(NanoDrop 2000)購自Thermo Scientific公司；實時熒光定量PCR儀(ABI7500)購自Applied Biosystems公司；梯度PCR儀(C1000)購自Bio-Rad公司。

1.1.3 培養(yǎng)基的配制 生長培養(yǎng)基：1% 青-鏈霉素+10%胎牛血清+DMEM高糖培養(yǎng)基；誘導(dǎo)培養(yǎng)基：DMEM高糖培養(yǎng)基+5 μg/mL胰島素+33 μmol/L生物素+17 μmol/L泛酸+0.25 mmol/L IBMX+0.1 μmol/L地塞米松+1 μmol/L羅格列酮+20 mmol/L HEPES；成熟培養(yǎng)基：DMEM高糖培養(yǎng)基+5 μg/mL胰島素+33 μmol/L生物素+17 μmol/L泛酸+0.1 μmol/L地塞米松+1 μmol/L羅格列酮+20 mmol/L HEPES。

1.2 方法

1.2.1 藏豬SVF細胞的分離及其誘導(dǎo)分化 將30日齡藏豬處死后用75%酒精消毒，取出腹股溝脂肪組織，用含有青-鏈霉素的DPBS洗3遍；將WAT剪至1 mm3大小用膠原酶Ⅰ(1.5 mg/mL)在37 ℃消化30 min；消化后用生長培養(yǎng)基終止消化；用70 μm一次性細胞篩過濾，將濾液收集到15 mL離心管中，1 500 r/min離心5 min；棄上清，加入5 mL紅細胞裂解液將底部沉淀輕柔吹打混勻，室溫放置5 min，1 500 r/min離心5 min；棄上清，加入DMEM生長培養(yǎng)基將底部細胞吹打混勻后接種于培養(yǎng)皿，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換1次液。細胞100%匯合后，繼續(xù)培養(yǎng)2 d(這種未分化的細胞定義為0 d)；更換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，第5天半量換液為成熟培養(yǎng)基；第6天換為DMEM生長培養(yǎng)基，之后每2 d換1次液；第10天收集細胞，―80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 豬SGK家族基因PCR擴增及測序 TRIzol法提取體外分化第10天的藏豬SVF細胞RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GenBank中公布的豬(Susscrofa)SGK1(NM_001244459.1)、SGK2(XM_021078159.1)和SGK3(XM_021089284.1)基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計3對特異性引物，引物信息見表1。引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系25 μL：2× PCR Buffer for KOD FX 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，KOD FX 0.5 μL，dNTPs 5 μL，ddH2O 3 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后，送北京擎科生物科技有限公司測序。

表1 引物信息

1.2.3 豬SGK家族基因生物信息學(xué)分析 采用ORF Finder工具進行開放閱讀框預(yù)測分析；采用DNAMAN 7.0軟件比對GenBank中公布的豬SGK家族基因序列與測序得到的DNA序列，明確SGK家族基因的起始密碼子和終止密碼子及各基因的SNP位點；據(jù)測序結(jié)果得到推測的蛋白序列，使用在線軟件ExPASy(https:∥web.expasy.org/protparam/)分析豬SGK家族蛋白的理化性質(zhì)，包括其基因組序列的編碼序列、開放閱讀框、分子質(zhì)量、等電點、疏水性；利用在線軟件WOLF PSORT(https:∥wolfpsort.hgc.jp)進行亞細胞定位預(yù)測；利用在線軟件MapGen2Ch(http:∥mg2c.iask.in/ mg2c%5Fv2.0)繪制染色體定位圖譜；利用在線軟件GSDS 2.0(http:∥gsds.cbi.pku.edu.cn)分析SGK家族基因外顯子分布；從UniProt網(wǎng)站(https:∥www.uniprot.org)下載人、小鼠、大鼠、牛、雞和斑馬魚的SGK家族基因氨基酸序列以及上述擴增的豬SGK家族基因完整ORF所編碼的氨基酸序列，用Mega X軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，校驗參數(shù)Bootstrap值設(shè)置為1 000，其他為默認(rèn)值；SGK家族基因的結(jié)構(gòu)域信息(PF00069和PF00433)下載自Pfam數(shù)據(jù)庫(https:∥pfam.xfam.org)，利用在線軟件SMART(http:∥smart.emblhei-delberg.de)進行確認(rèn)分析，將特征結(jié)構(gòu)域序列進行序列比對及l(fā)ogo分析；使用在線軟件MEME(http:∥memesuite.org/tools/meme)對豬SGK蛋白的保守基序進行分析，設(shè)置基序數(shù)量參數(shù)為5個，其余為默認(rèn)；采用DNAMAN 7.0軟件和在線軟件WebLogo(https:∥weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)分析SGK家族基因的保守序列。

1.2.4 組織和細胞中基因表達分析 利用TRIzol法提取巴馬豬心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、背部肌肉、腿部肌肉、頸部脂肪、背部脂肪、腹股溝脂肪、腎周脂肪等組織及藏豬SVF和由SVF分化10 d的脂肪細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，檢測各組織中SGK家族基因的表達量，檢測細胞中SGK家族基因及成脂分化標(biāo)記基因PPARγ、C/EBPα的表達量。根據(jù)GenBank公布的豬SGK家族基因的mRNA序列(NM_001244459.1、XM_021078159.1、XM_021089284.1)，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計實時熒光定量PCR引物，引物信息見表1。引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。以18S rRNA為內(nèi)參，進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系20 μL:SYBR Green Premix ExTaq10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，DyeⅡ 0.4 μL，cDNA 0.8 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸34 s，共40個循環(huán)。用2-ΔΔCt法計算各基因的相對表達量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，用t檢驗進行組間差異分析。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用GraphPad Prism 6.0軟件作圖。P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 豬SGK家族基因擴增及測序

由圖1可知，SGK1、SGK2和SGK3擴增產(chǎn)物條帶單一、清晰，片段大小分別為1 296、1 104和1 473 bp，均與預(yù)期相符。測序結(jié)果證實SGK1、SGK2、SGK3 CDS區(qū)序列長度均與PCR結(jié)果一致。通過ORF Finder工具進行開放閱讀框預(yù)測分析，結(jié)果表明，SGK1、SGK2和SGK3基因分別編碼431、367和490個氨基酸。DNAMAN 7.0軟件分析表明，SGK家族基因起始密碼子均為ATG，SGK1基因的終止密碼子為TAG，SGK2和SGK3基因的終止密碼子為TGA。經(jīng)過與GenBank收錄的豬SGK家族基因序列比對后發(fā)現(xiàn)，SGK1基因無SNP；SGK2基因存在2個SNPs位點；SGK3基因存在1個SNP位點，編碼氨基酸均未發(fā)生變化。上傳SGK2和SGK3基因CDS區(qū)序列至NCBI獲得GenBank登錄號：OM212064、OM212065。

M,DL1500 DNA Marker;1-3,SGK1,SGK2,SGK3

2.2 豬SGK家族基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 理化性質(zhì) 通過ExPASy軟件包對蛋白序列進行分析發(fā)現(xiàn)，豬SGK家族蛋白分子質(zhì)量為41 402.32～56 412.39 u，等電點為6.45～8.71，SGK家族蛋白均為親水性蛋白，SGK1蛋白的等電點>7.0，為堿性蛋白，SGK2和SGK3為酸性蛋白。亞細胞定位預(yù)測結(jié)果表明，SGK1和SGK2定位于細胞質(zhì)，SGK3定位于細胞核(表2)。由圖2可知，SGK1基因位于1號染色體，SGK2基因位于17號染色體，SGK3基因位于4號染色體。

圖2 豬SGK家族基因在染色體上的分布

表2 豬SGK家族基因的序列特征

2.2.2SGK家族基因結(jié)構(gòu)及保守基序分析 GSDS 2.0工具分析表明，SGK1、SGK2基因均有12個外顯子，SGK3基因有16個外顯子。SGK家族基因組序列最長的是SGK3基因，長度超過1 400 bp。利用MEME對3個SGK蛋白進行保守基序鑒定，3個蛋白均含有基序1～5(圖3)。

A，豬SGK家族保守基序分布；B，基序logo分析

2.2.3 SGK家族蛋白結(jié)構(gòu)域組成及進化樹分析 Pfam數(shù)據(jù)庫分析表明，豬SGK家族中所有成員都含有特征保守結(jié)構(gòu)域，且該結(jié)構(gòu)域由258個氨基酸殘基組成，包括6個高度保守的組氨酸殘基(X)44-His-(X)13-His-(X)30-His-(X)26-His-(X)20-His-(X)116-His-(X)3，保守性高(圖4)。進化樹分析結(jié)果顯示，SGK家族成員均與豬和牛先聚為一支，再與人聚為一支；小鼠和大鼠聚為一支；SGK1和SGK3首先聚為一支，再與SGK2聚為一支；豬SGK蛋白與牛、人的SGK蛋白遺傳距離較近，與斑馬魚SGK蛋白距離最遠(圖5)。

A，縱坐標(biāo)為氨基酸序列堆疊的高度，表示該處的序列保守性；橫坐標(biāo)為氨基酸序列排列的順序，表示該位置的每個氨基酸的相對頻率；B，利用NovoPro在線多序列比對工具對保守結(jié)構(gòu)域進行比對

圖5 SGK蛋白的系統(tǒng)進化樹

2.3 SGK家族基因在豬不同組織、不同生長階段的表達

由圖6可知，SGK1和SGK3基因在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、多種肌肉及脂肪組織中廣泛表達，SGK2基因在不同組織中的表達量存在較大差異。SGK1和SGK3基因在豬肺臟中的表達量均顯著高于其他組織(P<0.05)；SGK3在背部肌肉和腿部肌肉中表達量最低；SGK2基因在頸部、背部、腹股溝、腎周脂肪中的表達量顯著高于其他組織(P<0.05)，在肝臟、腎臟中的表達量顯著高于脾臟、背部肌肉、腿部肌肉(P<0.05)，在心臟、肺臟中的表達量最低。相較于7日齡，SGK1和SGK2基因在4月齡豬腹股溝脂肪組織中極顯著下調(diào)(P<0.01)，SGK3基因無顯著差異(P>0.05)。

①A～C,SGK家族基因在豬不同組織中的表達；D,SGK家族基因在7日齡和4月齡豬腹股溝脂肪組織中的表達。②肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。③**，差異極顯著(P<0.01)；無*，差異不顯著(P>0.05)。下同

2.4 SGK家族基因在豬脂肪細胞分化前后的表達

與分化前的SVF細胞相比，在分化第10天的成熟脂肪細胞中C/EBPα和PPARγ基因的表達量極顯著上調(diào)(P<0.01)(圖7A)；SGK1和SGK2基因在成熟脂肪細胞中表達量極顯著上調(diào)(P<0.01)，而SGK3基因的表達量在分化前后無顯著差異(P>0.05)(圖7B)。

圖7 成脂分化標(biāo)記基因(A)和SGK家族基因(B)在分化前后脂肪細胞中的表達

3 討 論

為挖掘與豬脂肪沉積相關(guān)的基因，本研究對豬SGK家族基因進行解析，成功獲得了SGK家族基因SGK1、SGK2和SGK3 CDS區(qū)序列，片段長度分別為1 296、1 104和1 473 bp，分別編碼431、367和490個氨基酸，該結(jié)果與GenBank中預(yù)測的一致。對基因外顯子進行研究，有助于了解該基因在結(jié)構(gòu)和功能上的差異，豬SGK1和SGK2基因的外顯子數(shù)量一致，說明SGK1和SGK2基因較為保守。對3個SGK蛋白進行保守基序鑒定，發(fā)現(xiàn)3個蛋白均具有5個保守基序。豬SGK蛋白序列均含有一段由258個保守氨基酸構(gòu)成的序列(X)44-His-(X)13-His-o p(X)30-His-(X)26-His-(X)20-His-(X)116-His-(X)3，該結(jié)構(gòu)域是蛋白激酶的催化結(jié)構(gòu)域，具有共同的結(jié)構(gòu)特征，可參與ATP結(jié)合。系統(tǒng)進化樹結(jié)果表明，豬SGK蛋白與牛和人的遺傳距離較近，與斑馬魚的遺傳距離最遠，表明SGK家族在哺乳動物中高度保守，可能具有相似的生理功能。通過以上對SGK家族蛋白信息和基因結(jié)構(gòu)進行系統(tǒng)地分析，發(fā)現(xiàn)SGK家族蛋白保守性高，穩(wěn)定性好。

本試驗結(jié)果表明，SGK1和SGK3基因在豬各組織中均有表達，SGK2基因在肝臟、腎臟和不同脂肪組織中高表達，表明SGK2具有高度組織特異性，可能在特定器官及組織中發(fā)揮重要作用。相較于4月齡豬，7日齡仔豬的脂肪組織未發(fā)育成熟，含有大量的前脂肪細胞，成脂能力較強。本研究對不同日齡巴馬豬脂肪組織中SGK家族基因進行表達分析，發(fā)現(xiàn)SGK1和SGK2在7日齡仔豬脂肪組織中表達量較高，在脂肪組織中SGK1和SGK2基因表達量高于SGK3基因，表明SGK1和SGK2可能參與豬早期脂肪發(fā)育，對脂肪組織的形成至關(guān)重要。豬SVF細胞成脂分化檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SGK1和SGK2基因在分化后的前脂肪細胞中表達量顯著升高，而SGK3基因沒有變化，表明SGK1和SGK2可能參與了豬前體脂肪細胞的分化，在體外脂肪細胞形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，SGK3未參與脂肪細胞的分化。除此之外，在腹股溝脂肪組織中SGK2基因表達量高于SGK1基因，在分化成熟的脂肪細胞中SGK1基因的表達量高于SGK2基因，這可能是因為脂肪組織除脂肪細胞外還包含成纖維細胞、前脂肪細胞、單核細胞、巨噬細胞、血管基質(zhì)細胞和神經(jīng)細胞[29]，成熟的細胞僅由SVF細胞分化而來，SGK2基因可能在除脂肪細胞外的其他細胞中也有較高表達，故SGK2基因在組織中表達量高于SGK1基因。有報道稱，在脂肪細胞體外誘導(dǎo)分化過程中地塞米松可誘導(dǎo)SGK1基因表達上調(diào)[30]，這可能也是在誘導(dǎo)分化的細胞中SGK1基因表達量較高的原因之一。

研究表明，SGK1受脂肪細胞代謝相關(guān)因子調(diào)節(jié)，可通過FOXO1參與脂肪細胞分化[24]。SGK1在肥胖和糖尿病患者的脂肪組織中高表達，與肥胖相關(guān)的炎癥反應(yīng)相關(guān)[22]。SGK1基因敲除小鼠對胰島素、糖皮質(zhì)激素敏感性降低，誘導(dǎo)SGK1表達有助于改善葡萄糖代謝和胰島素敏感性[31]。SGK2對脂肪形成作用的研究尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，在豬的脂肪組織中SGK1與SGK2基因均高表達，且SGK2與SGK1基因均在7日齡仔豬的脂肪組織中高表達，表明SGK2與SGK1可能在功能上一致，在脂肪組織中發(fā)揮重要功能。鑒于SGK2在腎上皮細胞細胞Na+通道中的重要作用[16]，推測SGK2可能通過調(diào)節(jié)離子通道參與脂質(zhì)代謝。本研究結(jié)果表明，SGK家族中SGK1和SGK2參與豬脂肪沉積及脂肪細胞分化，推測二者可能在豬脂肪發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié) 論

SGK1、SGK2和SGK3基因CDS區(qū)序列全長分別為1 296、1 104和1 473 bp，分別編碼431、367和490個氨基酸，它們編碼的蛋白具有相同的特征結(jié)構(gòu)域及保守基序。SGK1和SGK3基因廣泛表達于多種組織器官，SGK2基因在頸部、背膘、腹股溝、腎周的脂肪組織中表達量較高。SGK1和SGK2基因在成脂能力較強的早期脂肪組織中及在體外分化的脂肪細胞中高表達。表明SGK1和SGK2參與豬脂肪沉積及脂肪細胞分化，可作為研究豬脂肪沉積的重要候選基因。