廣西地區不同飼養模式及不同季節水牛奶霉菌毒素污染狀況調查

唐慶鳳，李 玲，黃加祥，方文遠，農皓如，唐 艷，陸呈委，韋盤秋，馮 玲

(1.中國農業科學院廣西水牛研究所，南寧 530001；2.廣西壯族自治區水牛乳質量與安全控制技術工程研究中心，南寧 530001；3.廣西大學動物科學技術學院，南寧 530005)

近年來國內外牛奶質量安全問題頻發，牛奶中霉菌毒素的污染嚴重威脅著消費者的健康[1-3]。霉菌毒素是由曲霉、鐮刀菌和青霉等絲狀真菌產生的次級代謝產物，在牛奶、奶制品、谷類飼料等農畜產品中廣泛存在[4]。霉菌毒素對動物及人體具有致癌性、腎臟毒性、肝臟毒性、雌激素樣作用、遺傳毒性、免疫抑制、生殖障礙及刺激皮膚等效應[5]。中國谷物霉菌毒素污染現象較為嚴重，污染率達90%以上[6-7]。奶牛采食霉菌毒素污染的飼料后，在牛奶中可檢測到相應霉菌毒素和代謝產物[8]。鄭楠等[9]報道，霉菌毒素在牛奶中常見的種類為飼料中原毒素及其經過牛體的代謝產物，將牛奶中常見的霉菌毒素按照風險指標重要程度依次排序為黃曲霉毒素M1(AFM1)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、α-玉米赤霉烯醇(α-ZEL)、T-2毒素(T-2)、HT-2毒素(HT-2)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)和伏馬菌素(FB)。國內外學者均報道了水牛奶也存在霉菌毒素污染問題[10-12]。因此，研究廣西地區水牛奶的霉菌毒素污染狀況，保障廣西地區安全生產水牛奶，對廣西地區乃至全國的水牛奶產業發展意義重大。

以往研究主要針對水牛奶中AFM1的污染情況進行調查[12]，而少有同時檢測水牛奶中AFM1及HT-2、T-2、α-ZEL、ZEN、DON、OTA的報道。雖然近年來規模化養殖是乳用水牛產業發展的方向，但廣西區乳用水牛養殖仍以散養為主，且養殖合作社或養殖小區飼養模式也占有一定的比例。在以往的研究中，很少有學者探究規模化養殖、養殖合作社或養殖小區、農戶散養這3種飼養模式水牛奶中霉菌毒物污染的水平。另外，廣西位于中國華南地區，位于北緯20°54′―26°24′、東經104°28′―112°04′之間，南臨熱帶海洋，北接南嶺山地，西延云貴高原，屬亞熱帶季風氣候區[13]，由于受季風影響，廣西降水量季節分配不均，干濕季分明，在春季的3―4月時降雨頻繁，易出現回南天，回南天出現時，空氣濕度接近飽和，飼料原料易產生霉菌毒素，從而易引起水牛奶霉菌毒素污染。秋季(9―11月)是干季，干燥少雨，如2020年秋季總降水量僅占全年降水量的18.36%[14]，飼料原料不易產生霉菌毒素，從而有利于降低水牛奶中霉菌毒素污染風險。因此，本研究在2020年10―11月(秋季，干燥氣候)和2021年4月(春季，回南天)以廣西地區乳用水牛規模化養殖場(存欄50頭以上)、養殖合作社或養殖小區、乳用水牛養殖戶(散養)的秋季和春季原料水牛奶樣品為研究對象，檢測水牛奶霉菌毒素的污染水平，追蹤水牛奶中霉菌毒素污染的季節變化，了解不同飼養模式及季節對水牛奶質量安全的影響，從而為水牛奶安全生產與消費提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在2020年10―11月和2021年4月，選取廣西地區乳用水牛主產區南寧市、欽北防、玉林等地采集水牛奶樣品。其中，每季規模化(存欄50頭以上)、養殖合作社或養殖小區、散養各飼養模式隨機采集原料水牛奶樣品8個，每季24個樣品，共計48個樣品，每個樣品取450 mL，樣品采集分布情況見表1。奶樣采集有奶罐和奶桶2種方式：奶罐采樣：采樣前將奶罐中的生鮮乳緩慢攪動后分別從奶罐的上、中和下部1/3處分別取生鮮乳樣品150 mL，混合成450 mL奶樣[15]；奶桶采樣：將奶搖勻，隨機取樣450 mL。奶樣采集分裝后，立即放入干冰中，然后轉移至―20 ℃保存備用。

表1 樣品分布情況

1.2 主要試劑及儀器

AFM1試劑盒購自北京美正生物科技有限公司；HT-2、T-2、α-ZEL、ZEN、DON和OTA試劑盒均購自南京森貝伽生物科技有限公司。主要儀器有：酶標儀(Bio-Rad iMark 12708，伯樂公司)；生化培養箱(SHP-150，上海精宏實驗設備有限公司)；FOSS多功能乳品分析儀(FT-120，福斯公司)。

1.3 霉菌毒素測定

按照ELISA試劑盒說明書檢測水牛奶中AFM1、HT-2、T-2、α-ZEL、ZEN、DON和OTA的含量。

1.4 牛奶中霉菌毒素限量

AFM1已被國際癌癥研究機構列為Ⅰ類致癌物質，OTA被列為Ⅱ類致癌物質[16]，但全球目前僅對牛奶中AFM1制定了限量標準，少部分國家對OTA進行了限量，對于其他霉菌毒素只制定了每日最大容許攝入量(provisional maximum tolerable daily intake，PMTDI)等相關制度，具體情況見表2。

表2 水牛奶中霉菌毒素限量

續表

1.5 數據處理

試驗數據用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，Duncan氏法進行組間多重比較。結果用平均值±標準差表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 廣西地區不同飼養模式下水牛奶霉菌毒素的污染狀況

2.1.1 水牛奶中AFM1的污染狀況 由表3可知，各飼養模式生產的原料水牛奶中AFM1含量均無顯著差異(P>0.05)。在48個樣品中有16個檢出AFM1，檢出率為33.33%。其中，養殖合作社或養殖小區模式檢出率最高，為43.75%；散養模式最低，為18.75%。全部樣品的AFM1含量均低于中國限量標準0.5 μg/kg，但散養和規模化模式各有1個樣品，共計2個樣品(4.17%)超過歐盟限量標準0.05 μg/kg，散養模式樣品的平均含量高于其他2個飼養模式。

表3 不同飼養模式生產的原料水牛奶中AFM1含量

2.1.2 水牛奶中其他霉菌毒素的污染狀況 由表4可知，各飼養模式生產的原料水牛奶中HT-2、T-2、α-ZEL、ZEN和DON的成人PMTDI值都遠遠低于JECFA設定值，OTA的成人PTWI值也均低于JECFA設定值，且OTA的含量均低于歐盟限量標準(<2 ng/mL)。與養殖合作社或養殖小區模式相比，散養和規模化模式生產的原料水牛奶樣HT-2含量均顯著低于養殖合作社或養殖小區模式(P<0.05)。與散養模式相比，規模化模式生產的原料水牛奶樣T-2含量顯著降低(P<0.05)。各飼養模式生產的原料水牛奶中α-ZEL、ZEN、DON和OTA含量均無顯著差異(P>0.05)。

表4 不同養殖模式生產的原料水牛奶中其他霉菌毒素含量

2.2 廣西地區不同飼養模式下不同季節水牛奶中霉菌毒素的污染狀況

2.2.1 水牛奶中AFM1的污染狀況 由表5可知，春季和秋季各飼養模式生產的原料水牛奶中AFM1含量均低于中國限量標準0.5 μg/kg，但秋季散養和規模化養殖各有1個奶樣AFM1含量超過歐盟限量標準(0.05 μg/kg)，且秋季AFM1平均含量高于春季。春季樣品中AFM1的檢出率高于秋季，春季和秋季樣品中AFM1的檢出率分別為37.50%和29.17%。在3種飼養模式中，春秋兩季散養樣品中AFM1檢出率均最低，春季樣品中養殖合作社或養殖小區檢出率最高為62.50%，秋季樣品中規模化養殖場檢出率最高為37.50%。

表5 原料水牛奶中AFM1含量

2.2.2 水牛奶中OTA的污染狀況 由表6可知，春季和秋季各飼養模式生產的原料水牛奶中OTA的含量均低于歐盟限量標準2 ng/mL，OTA的成人PTWI均低于JECFA設定值100 ng/kg BW。秋季各飼養模式生產的原料水牛奶中OTA的平均含量均高于春季。

表6 原料水牛奶中OTA含量

2.2.3 水牛奶中HT-2和T-2的污染狀況 由表7和8可知，春季和秋季各模式生產的原料水牛奶中HT-2和T-2的成人PMTDI均遠遠低于JECFA設定值60 ng/kg BW。春季和秋季養殖合作社或養殖小區生產的原料水牛奶中HT-2含量均顯著高于散養和規模化飼養模式(P<0.05)。

表7 原料水牛奶中HT-2含量

表8 原料水牛奶中T-2毒素含量

2.2.4 水牛奶中ZEN和α-ZEL的污染狀況 由表9和10可知，春季和秋季各飼養模式生產的原料水牛奶中ZEN和α-ZEL秋季的成人PMTDI均遠遠低于JECFA設定值500 ng/kg BW。春季和秋季散養模式生產的水牛奶中ZEN和α-ZEL含量均最低。春季和秋季養殖合作社或養殖小區生產的水牛奶中α-ZEL含量均最高。

表9 原料水牛奶中ZEN含量

表10 原料水牛奶中α-ZEL含量

2.2.5 水牛奶中DON的污染狀況 由表11可知，春季和秋季各飼養模式生產的原料水牛奶中DON的成人PMTDI均遠遠低于JECFA設定值1 000 ng/kg BW。秋季各養殖模式生產的原料水牛奶中DON的平均含量均高于春季。

表11 原料水牛奶中DON含量

3 討 論

3.1 不同飼養模式下水牛奶中霉菌毒素的污染狀況分析

黃曲霉毒素(aflatoxins，AFs)由寄生曲霉、黃曲霉和少量特異曲霉等真菌經聚酮而產生的次級代謝產物[23]。目前，已發現有20多種AFs及相關衍生物[24]，其中，黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)毒性最強，在飼料收割或儲存不當時易產生AFB1從而污染飼料，當奶牛攝入被AFB1污染的飼料后分泌的牛奶中會出現AFB1的羥基化代謝產物AFM1[25-26]。牛奶經巴氏殺菌后，AFM1幾乎不被破壞，且AFM1具有強致癌性，嚴重影響人類健康，因此，許多國家和組織都調查了牛奶中AFM1的污染水平，且對乳及乳制品中AFM1設定了較為嚴格的限量標準[17-18,27-28]。謝文沛[29]在甘肅省7個市的奶牛規模化和散養共采集252個原料水牛奶樣品，126個(50%)檢測出AFM1，所有檢出樣品AFM1含量均低于中國的國家限量標準，其中3個(1.19%)樣品超過歐盟標準，規模場生產的牛奶中AFM1的平均含量和檢出率均低于散戶。本試驗結果表明，規模化和養殖合作社或養殖小區養殖生產的水牛奶中AFM1的平均含量低于散養，但水牛奶中AFM1的檢出率卻高于散養，可能由于散養飼喂的精料以品牌精料為主，飼料原料的霉菌毒素污染率低，且散養精粗飼料配比不固定，為降低飼養成本，會更多選擇新鮮粗飼料。另外，規模化和養殖合作社或養殖小區養殖飼喂青貯飼料較散養多，而青貯飼料是最容易受真菌感染的飼料品種之一[30]。國內對原料水牛奶中AFM1的污染水平研究較少，Guo等[31]2016―2017年從廣西、貴州、云南和廣東省的奶水牛養殖場采集136個原料水牛奶樣品，其中85個(62.5%)原料水牛奶樣品中檢測到AFM1，含量在4～243 ng/kg之間，均未超過中國限量標準，但8個(5.9%)樣品超過歐盟標準，其中，廣西樣45個樣品AFM1檢出率為66.7%，超歐盟標準的有4個(8.89%)。本試驗結果顯示，全部水牛奶樣品的AFM1含量均低于中國限量標準0.5 μg/kg，但樣品AFM1檢出率(33.33%)和超歐盟限量標準率(4.17%)均低于Guo等[31]的研究結果，可能由于近幾年廣西奶水牛養殖管理技術不斷提升，更注意飼料霉菌毒素污染控制。國外許多國家開展了水牛奶中AFM1污染水平研究，意大利南部、埃及伊斯梅利亞、土耳其、伊朗阿瓦茲和印度的水牛奶中AFM1的檢出率分別為7.2%[30]、52.0%[32]、27.0%[11]、38.7%[33]和50.0%[34]。Hussain等[35]采集了巴基斯坦旁遮普省55個水牛奶樣品，其中19個(34.5%)樣品檢出AFM1，15.8%樣品中AFM1含量高于歐盟標準。本研究的原料水牛奶AFM1檢出率高于意大利及土耳其，與Hussain等[35]研究結果相似。

目前，牛奶中霉菌毒素的研究主要集中在AFM1，然而，牛奶中還存在HT-2、T-2、α-ZEL、ZEN、DON、OTA等霉菌毒素，它們對動物及人類健康也會產生不同程度的影響。Huang等[36]開展牛奶中霉菌毒素檢測研究，發現牛奶中存在AFM1、OTA、ZEA和α-ZEL，其中，含2、3和4種霉菌毒素所占的比例分別為15.0%、45.0%和22.0%。Frey等[37]采集巴西68份液態奶樣本檢測其中黃曲霉毒素，結果表明AFM1、OTA、伏馬毒素B1(FB1)、FB2、α-ZEL和β-ZEL的檢出率分別為8.8%、25.0%、14.7%、4.4%、57.4%和41.2%，21個(30.9%)樣本中含有2～4種霉菌毒素，AFM1未超過巴西的限量標準(500 ng/L)，其他霉菌毒素的每日攝入量(PDI)均未高于推薦值。本試驗研究結果也表明，各飼養模式生產的原料水牛奶中HT-2、T-2、α-ZEL、ZEN和DON的成人PMTDI遠遠低于JECFA設定值。因此，廣西地區水牛奶是安全的，不會對消費者健康產生顯著影響。水牛奶中多種霉菌毒素共存現象可能與本研究采用的檢測方法的檢出限較低有關，還與中國飼料中存在多種霉菌毒素共污染嚴重有關[38]。

3.2 不同季節水牛奶中霉菌毒素的污染狀況分析

不同季節奶牛飼喂的飼料種類及飼糧配制不同均容易引起牛奶中霉菌毒素的含量出現顯著季節動態變化[39]。Roma等[30]開展意大利南部水牛奶和牛奶中AFM1污染水平及季節變化調查結果表明，水牛奶及牛奶中AFM1污染的發生率在秋季明顯高于溫暖季節(主要是春季)。Miocino-vic等[40]對塞爾維亞牛奶進行了為期3年(2013-2015年)的檢測結果表明，秋季奶樣中AFM1含量平均值在四季中最高。Marnissi等[41]采集摩洛哥4個行政管理區域傳統奶牛場的四季牛奶樣品48個，13個(27.08%)樣品檢出AFM1，其中有4個樣品(3個為秋季樣品)AFM1含量超過歐盟標準，秋季奶樣AFM1平均含量和檢出率均高于其他季節。謝文沛[29]研究表明，甘肅地區牛奶中AFM1的發生率和含量均在秋季呈現最大值，而夏季呈現最小值，且春季散戶牛奶中AFM1的檢出率高于規模場。本試驗結果也表明，秋季AFM1平均含量高于春季，且AFM1含量超過歐盟標準的2個樣品均來自秋季，但春季AFM1的檢出率高于秋季，可能由于廣西春季回南天空氣濕度大飼料普遍易受霉菌毒素的污染，而秋季AFM1平均含量高于春季，也可能是由于春季飼喂青綠飼料較秋季多，秋季大部分奶水牛養殖場飼喂青貯飼料偏多。研究表明青貯飼料較其他種類飼料AFB1污染程度較高[29]。本試驗結果散養春秋兩季樣品中AFM1檢出率均最低，可能是由于奶水牛散養飼喂品牌精料霉菌毒素污染少，且較規模化養殖飼喂青綠飼料較多，青貯飼料較少。Frey等[37]研究表明，巴西牛奶樣品中秋季OTA、FB1、FB2、α-ZEL和β-ZEL的PDI低于春季。本試驗結果顯示，秋季各飼養模式生產的原料水牛奶中OTA和DON的平均含量均高于春季，該試驗結果與Frey等[37]結果基本一致。綜上，廣西地區的原料水牛奶霉菌毒素污染程度秋季高于春季，但春季原料水牛奶中AFM1的檢出率高于秋季。

4 結 論

廣西地區各飼養模式生產的原料水牛奶中AFM1含量均低于中國限量標準，HT-2、T-2、α-ZEL、ZEN和DON的成人PMTDI和OTA的成人PTWI均低于JECFA設定值。原料水牛奶霉菌毒素污染程度秋季高于春季，但春季原料水牛奶中AFM1的檢出率高于秋季，散養春秋兩季樣品中AFM1檢出率均最低。因此，就霉菌毒素而言，當前廣西地區原料水牛奶是安全的。