藥用槐花抗炎活性的網絡藥理學分析

范秋雨，武建文，李煥榮

(北京農學院動物科學技術學院，動物類國家級實驗教學示范中心，北京 102206)

槐花為豆科植物槐(SophorajaponicaL.)的干燥花蕾及花，又名槐米、洋槐花，植物槐被譽為“中國學者樹”，是中國衛生健康部門首批公布的藥食兩用型花卉植物[1]。中國是藥用植物槐花的原產地及主要出口國，槐米資源豐富，既可食用又是一味良藥?；被ㄎ犊?，微寒，歸肝、大腸經，具有涼血止血、清肝瀉火功能，用于便血、痔瘡出血、崩漏、吐血、肝熱目赤、血痢、頭暈等癥[2]。不同炮制方式的槐花具有不同的功效，如槐花炭的涼血作用微弱，止血作用強[3]。

槐花的活性成分有植物甾類、鞣質、槲皮素[4]、山奈酚、異黃酮，異鼠李素、染料木素、蘆丁[5]等多種黃酮類化合物?；被ㄓ幸种蒲“寰奂痆6]、抗氧化[7]和抗炎[8]等功能，可增加毛細血管的穩定性，降低毛細血管的通透性和血管的脆性，減少患者因糖尿病合并高血壓出現的腦出血現象[9]。此外，槐花中的芳香甙能顯著抑制大鼠創傷性腳爪浮腫和阻止肺水腫、結膜炎的發生[10]。黃敏[11]研究結果顯示，復方槐花口服液除具有鎮痛、止血及抗局部感染的作用之外，還能抑制二甲苯所致的小鼠耳廓的炎癥腫脹。但槐花的主要作用成分、靶點和抗炎機制尚未明確。

鑒于此，本研究擬借助網絡藥理學方法，全面、系統地分析藥用槐花的主要活性成分、作用靶點、信號通路及抗炎作用機制，探究其潛在網絡化關聯，以期為進一步闡明槐花抗炎機制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 槐花潛在活性成分及作用靶點篩選

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine database and analysis platform，TCMSP，https:∥tcmsp-e.com/)檢索槐花的全部化合物成分及對應靶點[12]，以口服生物利用度(oral bio-availability，OB)≥30%和類藥性(drug likeness，DL)≥0.18作為篩選條件[13]，篩選槐花有效成分及對應靶點。

1.2 靶點基因標準化

在蛋白質數據庫Uniprot(https:∥www.uniprot.org/)中下載人類全基因名稱與槐花成分對應靶點進行一一匹配，得到相應靶點標準化的基因名稱，將活性成分和靶點基因導入Cytoscape 3.6.1軟件，以構建活性成分-靶點網絡圖[14]。

1.3 抗炎靶點篩選及有效成分-靶點網絡圖構建

在NCBI(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)、GeneCards(https:∥www.genecards.org/)、OMIM(https:∥www.omim.org/)數據庫中檢索抗炎相關的靶蛋白。提取槐花成分靶點與抗炎靶點的共有基因作為核心靶點，再將篩選出的活性成分及其作用的核心靶點導入Cytoscape 3.6.1軟件，構建成分-抗炎靶點網絡圖。

1.4 蛋白互作(PPI) 網絡圖構建

將篩選出的槐花主要靶點蛋白制表，按指引上傳至STRING平臺(https:∥string-db.org/)，物種設定為人，構建PPI網絡圖[15]。再將PPI網絡圖導入Cytoscape 3.6.1軟件進行拓撲屬性分析，利用插件“Network Analyse”的功能進行分析。度值和介數是反映一個節點在網絡中重要性的指標，選取度值和介數均高于平均值的靶標作為關鍵靶標，分析槐花抗炎靶點之間的相互作用。

1.5 GO功能和KEGG通路富集分析

利用DAVID數據庫(https:∥david.ncifcrf.gov/)對關鍵靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析[16]。

2 結 果

2.1 槐花潛在活性成分及作用靶點的篩選

從TCMSP數據庫中獲得槐花的化學成分27種，以OB≥30%和DL≥0.18為條件篩選槐花有效成分，共獲得槲皮素、異鼠李素、山奈酚、β-谷甾醇、N-[6-9-吖啶基氨基己基]苯甲酰胺、槲皮素-3-甲基醚6種活性成分，其對應靶點297個。具體信息見表1。

表1 槐花活性成分篩選結果

2.2 槐花活性成分-靶點網絡圖

利用UniProt數據庫將TCMSP預測得到的297個靶蛋白轉換為對應的靶基因，物種設定為人，得到229個標準化基因。將篩選出的6種活性成分及其作用的靶點導入Cytoscape 3.6.1軟件，構建活性成分-靶點網絡圖。由圖1可知，其包括163個節點(6種活性成分和157種相關靶點)和229條線，MOL000098(槲皮素)節點的連線最多,說明其在與靶點蛋白相互作用中起到關鍵作用，可能是槐花發揮藥效的主要成分，其次是異鼠李素、山奈酚等物質。

圖1 槐花主要有效成分-靶點網絡圖

2.3 抗炎靶點篩選及成分-靶點網絡圖構建結果

從NCBI、GeneCards、OMIM數據庫里以“Anti-inflammatory”為關鍵詞搜索抗炎基因，共找到10 030個抗炎基因。將229個槐花靶基因與10 030個抗炎相關基因映射后，得到共同靶基因221個，即為槐花抗炎作用靶點。運用Cytoscape 3.6.1軟件將6種活性成分及221個靶基因建立的活性成分-靶點網絡圖，共獲得165個節點、387條邊(圖2)，充分體現了槐花多成分、多靶點的作用機制。

圖2 槐花有效成分-抗炎靶點網絡圖

2.4 靶點PPI結果

由圖3可知，映射得到的221個靶基因構建的PPI網絡中包含152個節點和2 579條相互作用連線。PPI網絡平均度值為33.9，平均介數為0.638。據網絡拓撲學參數，共篩選出34個度值和介數均超過平均值的關鍵靶蛋白(IL10、NFKBIA、ICAM1、MMP2、BCL2L1、STAT1、VCAM1、IFNG、MAPK14、IL2、SERPINE1、CASP9、IKBKB、GSK3B、CRP、IL1A、MMP3、MPO、MMP1、NOS2、SELE、SPP1、PRKCA、CDKN1A、CXCL10、CCNB1、CD40LG、ESR2、HSPB1、RUNX2、CHUK、RB1、RAF1和IGFBP3)，即這34個靶點為槐花發揮抗炎作用的關鍵靶點。

圓圈代表目標蛋白質，直線代表蛋白質之間相互作用；兩個蛋白質相互作用越強，其連線越粗；不同顏色和形狀的線表示不同的相互作用

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析

使用DAVID 6.8平臺對篩選出的6個槐花抗炎活性關鍵靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析，GO功能富集分析得到GO條目24個(P<0.01)，其中與生物過程相關的條目16個，即RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、正調控轉錄DNA模板、凋亡過程的負調控、基因表達的正調控、炎癥反應和細胞對脂多糖的反應等；與分子功能相關的條目6個，即酶結合、轉錄因子結合、蛋白結合等；與細胞組分相關的條目2個，即細胞外間隙和細胞質基質(圖4)，KEGG信號通路21條(P<0.01，表2)，其中關鍵靶點基因與癌癥、乙型肝炎、HTLV-Ⅰ感染、甲型流感等信號通路密切相關。KEGG信號通路富集分析表明其他相關信號通路為TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、T細胞受體信號通路、NOD樣受體信號通路(圖5)。

圖4 槐花活性關鍵靶點GO功能分類

表2 槐花抗炎活性關鍵靶點相關KEGG信號通路

續表

3 討 論

槐花是一種具有涼血止血、清肝瀉火[17]等功效的藥食兩用植物。多數藥用植物的抗炎作用是對機體多環節、多途徑作用的共同結果，通過激發生物體內的內在抗炎因素，提高機體免疫力從而發揮抗炎作用[18]。槲皮素、異鼠李素、皂苷類和染料木素等是槐花的主要成分，具有抗炎、抗氧化、止血、降糖、降壓、增強免疫力及抗腫瘤等作用[19]。但其具體藥效成分及作用機理并不完全清楚。

本研究釆用網絡藥理學的方法對槐花的主要活性成分、作用靶點、相關生物信號通路等幾個方面的關聯性進行探討，發現槐花中的槲皮素可能是發揮藥效的主要物質，其次是異鼠李素、山奈酚等。研究表明，槲皮素具有抗炎[20]、抗氧化、抗腫瘤等廣泛的生理活性，可通過抑制NF-κB和Akt信號轉導通路而影響炎癥因子的表達，發揮抗炎作用[21]；此外，槲皮素可下調脂多糖(LPS)刺激的小膠質細胞炎癥因子[22]。異鼠李素作為槲皮素的直接衍生物，多存在于沙棘中，具有良好的抗炎、抗氧化、抗過敏等作用[23]，而其延緩LPS炎癥作用是通過NF-κB信號通路實現的[24]。山奈酚具有抗炎鎮痛的作用[25]。β-谷甾醇與阿司匹林聯合使用比單獨使用阿司匹林的抗炎效果更強[26]。說明槐花可能通過多成分聯合作用發揮抗炎活性。

通過槐花中多成分、多靶點、多通路作用于炎癥代謝多個途徑及炎癥發生發展的多個過程分析顯示，槐花抗炎作用主要涉及細胞因子、轉錄因子、抑制因子、趨化因子、蛋白(血管細胞黏附蛋白、急性相蛋白、E選擇素、熱休克蛋白、生長因子結合蛋白等)、酶等152個靶點。其中IL10是主要的免疫調節細胞因子，限制炎癥引起的過度組織破壞[27]。IL2可活化T細胞產生細胞因子，刺激機體產生抗體，同時能增強單核巨噬細胞系統的功能，間接發揮抗炎作用[28]。VCAM1是一種重要的細胞黏附因子，參與細胞的增殖分化等[29]。STAT1主要通過激活IFN參與表達細胞增殖分化相關的基因，激活機體的免疫系統，清除病原體[30]。NOS2是誘導型一氧化氮合酶，能促進一氧化氮的產生，作為炎癥介質廣泛參與炎癥、哮喘等疾病的病理發展過程[31]。CXCL10是一種趨化因子，參與周圍免疫細胞的趨化、分化和激活、細胞生長調節、凋亡和血管抑制效應的調節等多種過程[32]。CHUK絲氨酸激酶在NF-κB信號負反饋中發揮關鍵作用，限制炎癥基因的激活[33]。由此可見，槐花可能通過作用于這些關鍵靶點以實現其抗炎目的。

利用DAVID數據庫對槐花抗炎關鍵靶標基于生物過程、分子功能和細胞組分進行GO功能分析，顯示這些靶標主要分布在細胞外、細胞質、膜結合囊泡、核周區域等部位，與蛋白、脂肪酸、受體結合，調節蛋白激酶的活性，參與機體對多種物質刺激的反應過程。如可能參與RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、正調控轉錄DNA模板、凋亡過程的負調控、藥物反應、炎癥反應、基因表達的正調控和對LPS反應等作用。

對靶點進行KEGG通路分析發現，TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、T細胞受體信號通路和NOD樣受體信號通路為槐花抗炎的關鍵通路。TNF是一種重要的細胞因子，可誘導多種細胞內信號通路，包括凋亡、細胞存活及炎癥和免疫。TNFR1幾乎在所有細胞中表達，是TNF(也稱為TNF-α)的主要受體[34]，通過NF-κB途徑和MAPK級聯誘導許多基因的激活，調控細胞凋亡和壞死[35]。TNFR2可在多種免疫細胞中表達，是TNF和LTA(也稱為TNF-β)的受體[36]。Toll樣受體是一種模式識別受體，其MyD88依賴途徑通過快速激活NF-κB和MAPK產生促炎細胞因子[37]，而MyD88獨立途徑通過誘導IFN-β基因，緩慢激活NF-κB和MAPK誘導樹突狀細胞成熟[38]。NOD樣受體是特定的模式識別受體，識別各種病原體并產生先天免疫反應。NOD1和NOD2是2個典型的NLR，能驅動NF-κB和MAPK的激活，細胞因子的產生和凋亡[39]。不同的NLR通過炎癥小體的多蛋白復合物的組裝誘導Caspase-1激活[40]，調節促炎細胞因子IL1β、IL18的成熟并驅動焦亡[41]。以上分析表明槐花可能通過多層次、多途徑實現抗炎作用，但其具體的抗炎機制仍需進一步的驗證。

4 結 論

本研究結果表明，槐花通過多成分、多靶點、多通路參與機體抗炎的反應過程。該分析為闡明其抗炎成分及作用機制提供了一定的理論基礎，為槐花的進一步開發應用提供科學依據。