薯蕷皂苷元對順鉑誘導大鼠腎損傷的緩解作用

何炎峻，金圣子，王 爽，柳可欣，劉 云

(東北農業大學動物醫學學院，黑龍江省實驗動物與比較醫學重點實驗室，哈爾濱 150030)

犬腫瘤疾病在臨床上越來越常見，目前犬腫瘤疾病主要采用外科手術治療，結合化療藥物治療可明顯提高寵物存活率[1-2]。順鉑(cisplatin，CP)作為一種廣普抗腫瘤化療藥物，可用于治療多種癌癥。化療藥物無論在動物或者人身上，對惡性腫瘤都有明顯的抑制作用[3]。CP在治療犬乳腺腫瘤上有良好的效果，可以誘導犬乳腺腫瘤細胞凋亡[4]。但是CP具有嚴重的毒副作用，無論在人或動物的治療上都會引起嚴重的腎損傷，嚴重降低治療對象的生活質量，限制了CP的臨床應用[5]。CP主要由腎臟代謝，通過腎小球過濾或腎小管分泌，因此，CP容易在腎臟中蓄積而造成腎損傷[6]。當發生腎損傷時，通過病理切片檢查可發現腎小管上皮細胞壞死和空泡變性等腎損傷標志現象[7]。研究表明，CP能夠誘導腎臟氧化應激，降低總抗氧化能力(T-AOC)和過氧化氫酶(CAT)活性，促使腎臟中丙二醛(MDA)含量增加，破壞腎小管上皮細胞，加重腎臟損傷[8]；CP可導致腎臟中瘤壞死因子-α(TNF-α)、核因子κB p65(NFκB p65)和白細胞介素-1β(IL-1β)等炎癥因子增多，誘導炎癥損傷破壞腎小管結構，加重腎損傷[9]；CP還可誘導腎臟發生程序性壞死，從而在導致組織損傷同時誘導炎癥，導致腎小管結構破壞，程序性壞死標志物受體相互作用蛋白激酶-1(RIPK1)和RIPK3在組織中的表達增加[10]。CP作為一線抗腫瘤藥物，抗癌效果明顯，但其副作用對腎臟造成了嚴重損害。因此，亟需尋找一種合適的藥物來緩解CP對腎臟造成的損傷。

薯蕷皂苷元(diosgenin，Dio)是一種天然合成的淄體皂苷元，比較容易在山藥中提取到，具有抗腫瘤、抗氧化和抗炎的作用[11]。研究發現，Dio可以通過抑制氧化應激緩解脂多糖(LPS)誘導的腎損傷[12]；Dio不但可以減輕果糖誘導的腎臟病理組織改變，而且還可以通過緩解腎臟炎癥反應緩解其誘導的大鼠腎損傷[13-14]。此外，Dio還可以緩解大鼠心肌炎癥[15]。CP作為一種抗腫瘤化療藥物，找到能緩解CP誘導腎損傷的藥物對臨床具有重要的意義。因此，本試驗通過研究Dio干預對CP誘導的腎臟的病理變化、抗氧化能力、炎癥反應和細胞程序性壞死等的影響，以期為將Dio用于緩解CP誘導的腎損傷提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

薯蕷皂苷元(Dio，純度≥98%)(成都德賽特生物科技有限公司)；CP(Sigma-Aldrich公司)；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)(中國上海金品化工科技有限公司)；T-AOC、MDA和CAT檢測試劑盒(南京建城生物工程研究所)；BCA檢測試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；兔抗鼠TNF-α、IL-β、NFκB p65、環氧合酶-2(COX-2)、IL-10、GAPDH抗體(沈陽萬類生物科技有限公司)。

倒置熒光顯微鏡(Echo公司)；全自動化學發光系統(Amersham Imager600，GE公司)；紫外分光光度計(Cary8454 UV-Vis，安捷倫科技有限公司)；熒光定量PCR儀(LightCycler96,Roche公司)。

1.2 動物分組及處理

選取SPF級雄性Wistar大鼠24只(遼寧長生生物有限公司)，飼養溫度22～24 ℃，濕度50%～60%，室內光照12 h/12 h晝夜交替，自由采食和飲水，適應性飼養1周后進行試驗。將24只大鼠隨機分為4組，每組6只，分別為對照組(C)、Dio組(Dio)、模型組(CP)和Dio+CP組(Dio+CP)。C和CP組每天灌胃6 mL 0.5% CMC-Na，Dio和Dio+CP組每天灌胃Dio(60 mg/kg)[13]，連續灌胃10 d。于試驗第7天，CP和Dio+CP組尾靜脈單次注射CP(6 mg/kg)[16-17]，C和Dio組尾靜脈單次注射2 mL生理鹽水。CP給藥72 h后處死大鼠，無菌分離腎臟組織，一部分置于4%多聚甲醛中固定，一部分用液氮速凍后于―80 ℃保存備用。

1.3 氧化應激指標檢測

取0.3 g腎臟組織樣本勻漿，用生理鹽水按照1∶9的比例進行稀釋，3 500 r/min離心10 min，收集上清液，按照試劑盒說明書測定T-AOC和CAT的活性及MDA的含量。

1.4 組織病理學檢查

將固定于4%多聚甲醛中的腎臟修剪為0.5 cm，于包埋盒中流水沖洗過夜，將組織放入70%酒精2 h、80%酒精15 min、90%酒精10 min、95%酒精8 min、無水乙醇2 min進行梯度脫水，置二甲苯中6 min透明、浸蠟2.5 h，包埋后切成5 μm厚度的切片，在37 ℃水中展片，置于載玻片上，將載玻片放入二甲苯7 min、無水乙醇4 min、95%酒精5 min、90%酒精5 min、80%酒精3 min、蒸餾水3 min進行脫蠟，HE染色，光學顯微鏡下觀察腎臟組織病理變化。

1.5 實時熒光定量PCR檢測炎性因子mRNA表達

取0.1 g腎臟組織，采用總RNA提取試劑盒提取RNA并反轉錄合成cDNA。根據GenBank中大鼠TNF-α、NFκBp65、IL-10、COX-2和IL-1β基因的序列，用Primer Premier 5.0軟件設計引物，引物信息見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以GAPDH為內參基因，進行實時熒光定量PCR。PCR反應體系12 μL：上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.5 μL，2×TaqMasterMix 6.5 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環。熔解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。

表1 引物信息

續表

1.6 Western blotting檢測炎癥因子蛋白的表達

將0.5 g各組腎臟組織加入含有磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，充分裂解勻漿。將勻漿4 ℃、12 000×g離心20 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度。每組取30 μg蛋白上樣，SDS-PAGE電泳后轉至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST漂洗3次，分別加入兔抗鼠TNF-α(1∶500)、IL-β(1∶500)、NFκB p65(1∶500)、COX-2(1∶500)、IL-10(1∶500)、GAPDH(1∶500)一抗，室溫孵育12 h。然后用山羊抗兔二抗(1∶3 000)室溫下孵育1 h，TBST 洗滌后置ECL發光液中顯色，采用全自動化學發光系統觀察并拍照，最后用ImageJ Pro Plus 5.0軟件進行灰度分析。

1.7 免疫組化檢測RIPK1和RIPK3蛋白的表達

取各組大鼠腎臟組織，石蠟包埋后切片(5 μm)。石蠟切片脫蠟封閉后，分別加入兔抗鼠RIPK1(1∶200)和RIPK3(1∶200)一抗，4 ℃孵育過夜；清洗后滴加山羊抗兔二抗(1∶150)，37 ℃靜置30 min；洗滌后滴加DAB顯色液避光顯色，蘇木精復染，中性樹脂封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 數據統計與分析

用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，用LSD法進行組間差異比較，結果用平均值±標準差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 Dio對CP所致大鼠腎損傷的影響

由圖1可知，對照組和Dio組腎臟結構未見明顯異常；CP組腎小管上皮細胞腫脹、壞死和脫落，并且腎小管發生大面積空泡變性；Dio+CP組腎小管損傷明顯減輕。說明腎損傷模型構建成功。

黑色箭頭指示腎小管病變

2.2 Dio對CP誘導的腎臟氧化應激的影響

由表2可知，與對照組相比，Dio組大鼠腎臟中MDA含量、T-AOC和CAT活性均無顯著差異(P>0.05)，CP和Dio+CP組腎臟中MDA含量均極顯著升高(P<0.01)，T-AOC和CAT活性均極顯著降低(P<0.01)；與CP組相比，Dio+CP組腎臟中T-AOC和CAT活性均極顯著增加(P<0.01)，MDA含量極顯著降低(P<0.01)。

表2 各組氧化應激指標檢測結果

2.3 Dio對CP誘導的大鼠腎臟炎癥反應的影響

2.3.1 Dio對CP誘導的大鼠腎臟炎癥相關因子mRNA表達的影響 由表3可知，與對照組相比，Dio組大鼠腎臟中TNF-α、COX-2、NFκB p65、IL-1β和IL-10 mRNA的表達量均無顯著差異(P>0.05)，CP組大鼠腎臟中TNF-α、COX-2、NFκB p65和IL-1β mRNA的表達量均極顯著升高、IL-10 mRNA的表達量極顯著降低(P<0.01)，Dio+CP組大鼠腎臟中IL-1β mRNA的表達量顯著升高(P<0.05)、IL-10 mRNA的表達量極顯著降低(P<0.01)；與CP組相比，Dio+CP組大鼠腎臟中TNF-α、COX-2、NFκB p65和IL-1β mRNA的表達量均顯著降低(P<0.05)，IL-10 mRNA的表達量極顯著升高(P<0.01)。

表3 各組大鼠腎臟中炎癥相關因子mRNA的相對表達量

2.3.2 Dio對CP誘導的大鼠腎臟炎癥相關因子蛋白表達的影響 由表4可知，與對照組相比，Dio組大鼠腎臟中IL-1β、TNF-α、NFκB p65、IL-10和COX-2蛋白的表達量均無顯著差異(P>0.05)，CP組大鼠腎臟中TNF-α、COX-2、NFκB p65和IL-1β蛋白的表達量極顯著升高、IL-10蛋白的表達量極顯著降低(P<0.01)，Dio+CP組TNF-α和IL-1β蛋白的表達量分別極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)升高；與CP組相比，Dio+CP組大鼠腎臟中COX-2和NFκB p65蛋白的表達量顯著降低(P<0.05)，TNF-α和IL-1β蛋白的表達量極顯著降低(P<0.01)，IL-10蛋白的表達量極顯著升高(P<0.01)。

表4 各組大鼠腎臟中炎癥相關因子蛋白的相對表達量

2.4 Dio對CP誘導的大鼠腎臟中RIPK1和RIPK3蛋白表達的影響

由圖2可知，RIPK1和RIPK3陽性表達呈棕黃色顆粒，對照組中RIPK1和RIPK3少量表達。由表5可知，與對照組相比，Dio組大鼠腎臟中RIPK1和RIPK3蛋白的表達水平均無顯著差異(P>0.05)；CP和Dio+CP組大鼠腎臟中RIPK1和RIPK3的蛋白表達量均極顯著升高(P<0.01)；與CP組相比，Dio+CP組大鼠腎臟中RIPK1和RIPK3蛋白的表達分別極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)降低。

黑色箭頭指示陽性標志物

表5 各組大鼠腎臟中RIPK1和RIPK3蛋白陽性表達率

3 討 論

CP是一種常見的化療藥物，其抗癌廣、療效確切、無交叉耐藥性，廣泛應用于惡性腫瘤治療[3]，但具有較大的副作用，無論在人或者動物上，CP治療后均會導致嚴重的腎損傷[18]，亟需藥物來緩解CP誘導的腎損傷，以促進CP在醫療上的應用。研究發現，CP誘導腎損傷時，直接的病理表現為腎小管上皮細胞脫落和壞死[19]。本研究結果發現，CP處理后大鼠腎小管出現大面積上皮細胞腫脹、空泡變性，表明CP破壞了腎臟結構，造成了腎損傷。王延輝等[20]研究發現，Dio可以促進腎小管受損細胞修復，增強腎臟功能，加快代謝，與本研究的結果相似。表明Dio干預顯著減輕了CP誘導的腎損傷。

研究表明，CP會誘導或加劇腎臟的氧化應激損傷，造成明顯腎功能紊亂、加重腎損傷[21]；CP可誘導細胞內ROS增加，當ROS在細胞內的蓄積量超出機體的清除能力時便會造成氧化應激損傷[19]；CP還會降低內源性抗氧化酶的活性，使機體總抗氧化能力降低、抗氧化與氧化作用失衡[13]。MDA是過氧化產物，可通過腎臟中MDA含量判斷氧化損傷程度[22]。衡量機體抗氧化能力的指標有T-AOC和CAT活性，而Dio可以通過提高機體抗氧化酶活性而提高機體抗氧化能力[23-25]。本研究結果發現，CP可顯著降低腎臟中T-AOC和CAT活性，而Dio干預則顯著緩解了腎臟的氧化應激反應。曹亞軍等[21]研究發現，薯蕷皂苷能顯著降低衰老小鼠血清、肝臟和腦組織中MDA含量，提高機體抗氧化能力。Dio可以通過提高CAT活性和降低MDA含量緩解痛性糖尿病周圍神經病變坐骨神經中氧化應激損傷[23]。本試驗結果表明，與模型組相比，Dio干預顯著降低了腎臟中MDA含量，提高了腎臟中T-AOC和CAT活性。以上結果均表明Dio可以通過抑制氧化應激緩解腎損傷。

給予CP會在腎臟近端小管大量聚集，引發腎臟炎癥反應從而加重腎損傷[26]。一般認為IL-1β、TNF-α、COX-2和NFκB p65是腎臟中重要的促炎因子，而IL-10作為抑炎因子可以抑制炎癥[27-28]。本研究結果發現，CP引發腎損傷時，大鼠腎臟中TNF-α、COX-2、NFκB p65和IL-1β蛋白的表達顯著升高，而IL-10蛋白的表達則顯著降低。褚春民等[29]研究發現，TNF-α、NFκB p65和COX-2在炎癥組織中蛋白的表達水平顯著高于正常組織，Dio可以顯著降低TNF-α、NFκB p65和COX-2的表達水平，減輕炎癥。Qiao等[13]研究發現，Dio可通過降低腎臟中TNF-α、COX-2、NFκB p65和IL-1β等炎癥因子蛋白的表達水平緩解果糖誘導的腎損傷。也有研究表明，Dio可以提高機體IL-10抗炎因子的表達，從而發揮抗炎作用[30]。本研究結果與以上結果一致，Dio干預顯著降低了腎臟組織中TNF-α、COX-2、NFκB p65和IL-1β蛋白的表達量，升高了IL-10蛋白的表達量，表明Dio能顯著緩解CP誘導的腎臟炎癥。程序性壞死是由基因調控的一種死亡方式，其信號調控十分復雜，目前認為RIPK1和RIPK3參與調控程序性壞死的重要過程，是程序性壞死的陽性標志物[31-32]。研究發現，RIPK1和RIPK3是程序性壞死中的重要調節物，當腎臟發生程序性壞死時，RIPK1和RIPK3蛋白在腎組織中表達升高[33]。本研究結果發現，CP處理后大鼠腎組織RIPK1和RIPK3蛋白的表達量顯著升高，表明在CP誘導腎損傷的過程中程序性壞死被激活。研究表明，細胞發生程序性壞死后，細胞膜破裂導致內容物釋放，內容物作為內源性危險信號(DAMPs)引發周圍組織發生免疫和炎癥反應[34]。在腎臟中高濃度CP可激活程序性壞死，引發腎臟炎癥反應[9,35]。本研究結果發現，CP可以通過激活程序性壞死增加TNF-α、COX-2、NFκB p65和IL-1β炎癥細胞因子的分泌，加重腎臟炎癥反應。研究表明，抑制RIPK1和RIPK3的表達可以減輕程序性壞死[36]。也有研究表明，RIPK3基因缺陷的小鼠不能發生程序性壞死[37]。本試驗結果表明，與模型組相比，Dio干預顯著降低了腎臟中RIPK1和RIPK3蛋白的表達，抑制了促炎因子TNF-α、COX-2、NFκB p65和IL-1β的表達。說明Dio緩解CP誘導的腎損傷機制與其抑制程序性壞死的激活和炎癥反應密切相關。

4 結 論

本研究結果表明，Dio干預可顯著降低腎臟中MDA含量，降低TNF-α、COX-2、IL-1β等炎癥相關蛋白及RIPK1、RIPK3蛋白的表達。說明Dio干預可緩解CP誘導的腎損傷，其作用可能與抑制腎臟氧化應激、炎癥反應和細胞程序性壞死密切相關。