Wip1基因對動物繁殖及免疫的調節作用

王 悅，鄭云曦，徐松松，向光明，李 華，王 楠，馮 政，李 奎，牟玉蓮

(1.佛山科學技術學院生命科學與工程學院，廣東省動物分子設計與精準育種重點實驗室，佛山 528225；2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193；3.南昌大學瑪麗女王學院，南昌 330031；4.中國農業科學院農業基因組研究所，深圳 518120)

野生型p53誘導的磷酸酶1(wild-type p53-induced phosphatasel,Wip1)又名蛋白磷酸酶Mg2+/Mn2+依賴性1D(protein phosphatase,Mg2+/Mn2+dependent 1D,PPM1D)，是一種絲/蘇氨酸磷酸酶，屬于蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase type 2C,PP2C)家族。Wip1基因通過調控機體內一些重要信號分子，如p53、p38 MAPK、ATM、Chk1/2、MDM2等，影響細胞增殖、分化、衰老、凋亡、自噬以及DNA損傷修復等過程。此外，Wip1基因也在繁殖調控、免疫調節等方面發揮著重要作用。作者主要綜述了Wip1基因對動物繁殖及免疫炎癥的調節作用，以期為家畜育種、疾病防治及靶向治療提供新思路。

1 Wip1基因的發現及結構特征

Fiscella等[1]研究發現，淋巴瘤細胞在紫外線照射下表達野生型p53基因誘導的蛋白，且該蛋白不僅表現出依賴于Mg2+的PP2C特征，而且依賴于野生型p53，即在細胞應激時p53靶向作用于其編碼基因，因此命名為Wip1。作為PP2C家族中的一員，Wip1由PPM1D基因編碼。Wip1基因位于人17號染色體、小鼠11號染色體、豬12號染色體上。Wip1基因在小鼠和豬中均有6個外顯子，而在人中有7個外顯子。小鼠與人Wip1蛋白總體相似性為83%，與人、果蠅等其他PP2C序列也有很高的相似性，且在物種之間有幾個明顯的保守區，特別是在基因的中心區域，表明PP2C家族在進化上具有保守性[2-3]。人Wip1蛋白結構包含2個主要結構域，即第1―375位氨基酸為高度保守的N-端磷酸酶結構域，第376―605位氨基酸為不太保守的非催化結構域[4]。Wip1蛋白N-端能夠靶向識別p(S/T)Q序列中的絲氨酸、蘇氨酸等[5-6]，是發揮去磷酸化功能的位點。

2 Wip1基因的生物學功能

為了抵御基因組如錯配、單鏈和雙鏈斷裂等DNA損傷威脅，細胞進化出DNA損傷反應機制來維持基因組完整性。Wip1通過去磷酸化DNA損傷反應蛋白，即p53、ATM、Chk2、MDM2、p38 MAPK等，來抑制應激反應，終止DNA損傷。因此，Wip1可以消除細胞周期檢查點，抑制衰老、凋亡、DNA修復和炎性細胞因子的產生[7-9]。Wip1基因能通過調控細胞周期在神經系統中產生影響，還可通過抑制p53的活性阻礙G2/M細胞周期的進行，從而減少細胞的生成，維持了中樞神經系統穩態，在成年神經干細胞(adult neural stem/progenitor cells,NPCs)中的研究也表現出同樣的結果[10]。Wip1基因會阻礙染色體復合體向中心紡錘體遷移過程，從而抑制細胞有絲分裂的發生，使細胞增殖速度減緩[11-12]。Wip1基因能夠調控小鼠胚胎中造血干細胞的增殖發育，其調節機制可能是由mTORC1信號通路所致[13-14]。在急性髓系白血病細胞中也有類似的研究，如應用小RNA干擾技術抑制Wip1基因后，表現為細胞增殖被抑制，同時細胞凋亡被促進，p38 MAPK/p53信號通路被激活[15]。Wip1基因沉默可促進妥唑胺誘導的細胞增殖，誘導細胞凋亡和細胞周期停滯[16]。雙鏈DNA斷裂在G2階段激活DNA損傷檢查點以觸發細胞周期停滯，G2期間細胞受損會永久退出細胞周期，進入衰老或凋亡。Wip1基因缺失會導致G2期p53的異常高活化和同源重組缺陷，這兩者都會導致DNA修復受阻和細胞衰老[17-19]，Wip1基因敲除小鼠的造血干細胞表現出衰老表型[13]。He等[20]構建Wip1基因敲除小鼠模型發現，Wip1基因敲除會使γH2AX去磷酸化進而促進海馬細胞衰老，從而導致Wip1基因敲除小鼠抑郁。miR-16與p53和Wip1基因的信號通路反饋環也可調節細胞凋亡和衰老[21]。另外，Wip1基因可通過STING/TBK1/IRF3信號通路調節細胞自噬[22]。以上研究表明，Wip1基因具有重要的生物學功能。

3 Wip1基因影響動物繁殖調控過程

基于Wip1基因在細胞周期、增殖、凋亡等方面的功能，其在動物繁殖調控方面也取得了進展。半定量PCR和Northern blotting技術檢測發現，Wip1基因在小鼠胚胎及成體鼠肝臟、心臟、腎臟、睪丸、附睪等組織中均有表達，尤其在睪丸中表達最高，且隨著日齡的增長Wip1基因mRNA在小鼠睪丸中的表達量不斷升高[23]，表明Wip1基因可能與睪丸的發育有關。睪丸切片和免疫熒光染色結果顯示，Wip1基因在圓形精細胞、長形精子中都有表達[23-24]，表明Wip1基因還可能和精子生成有關。小鼠體外受精結果發現，Wip1基因敲除小鼠精子游動能力弱，而其2-細胞發育率和囊胚率均極顯著低于野生型小鼠[24]，這進一步證明了Wip1基因可調控小鼠的精子發生過程。Choi等[23]研究發現，Wip1基因敲除雄性小鼠與野生型雌鼠交配產生的后代明顯減少，提示Wip1基因敲除可能會降低雄性小鼠生育能力。組織病理學研究發現，Wip1基因敲除導致小鼠生精小管退化和空泡化，失去正常細胞結構，推測可能是Wip1基因敲除導致雄性小鼠體內生殖激素水平失衡進而影響精子生成，且Wip1基因敲除小鼠的血清睪酮含量極顯著低于野生型小鼠[24]，進一步佐證了Choi等[23]的研究結果。

隨著研究的不斷深入，Wip1基因對雄性繁殖的影響越來越受到關注。Filipponi等[25]研究報道，Wip1基因敲除雄鼠睪丸重量減少、睪丸結構異常、分化程度高的生殖細胞類型缺失、魚精蛋白表達量降低、精子數量明顯下降，這證實了Wip1基因缺失能夠影響精子的發生；并進一步揭示了Wip1基因敲除通過激活ATM信號通路來調控乳腺癌1(breast cancer 1，BRCA1)和異染色質蛋白1(heterochromatin protein 1，HP1)的互作，使DNA甲基轉移酶被招募至異染色質區域，提高異染色質區域的甲基化水平，導致DNA重復序列元件的沉默，進而干擾精子發生相關基因的正常表達，致使小鼠生殖能力下降。Wip1基因在雄性小鼠生殖發育過程中可促進Nemo樣激酶(Nemo-like kinase，NLK)去磷酸化，從而激活Wnt信號通路，影響小鼠的精子生成[26]。因此，初步判斷Wip1基因主要通過調控ATM和Wnt等信號通路來影響精子發生，進而影響生殖。Niu等[27]利用蛋白質組學技術篩選Wip1基因敲除雄性小鼠與野生型小鼠附睪組織的差異表達蛋白發現，這些蛋白主要富集于Smac/Diablo介導的凋亡通路和SERPINA3介導的炎癥通路，推測Wip1基因可能通過調控以上2個通路影響精子生成過程。Wei等[28]在Wip1基因敲除雄性小鼠模型中利用定量蛋白質組學方法對睪丸組織分析發現，大部分差異表達蛋白和磷酸化蛋白主要參與了細胞黏附/緊密連接、凋亡過程、炎癥反應、精子發生和運動等生物學過程，進一步證實Wip1基因敲除導致睪丸組織緊密連接蛋白(如Occludin、ZO-1和N-cadherin)表達降低，提示Wip1基因敲除導致睪丸組織中血睪屏障完整性受損，從而影響精子發生過程。

雖然Wip1基因能夠影響小鼠雄性繁殖能力，但其在豬中是否也具有同樣的作用呢？豬睪丸細胞對睪丸功能和精子發生起著調節作用，可影響公豬繁殖能力。Wip1基因敲除的豬睪丸細胞可為了解Wip1與細胞增殖、凋亡的關系提供良好的細胞模型[29]。Wang等[30]通過研究Wip1基因與豬睪丸細胞增殖發育關系表明，Wip1基因可能通過抑制p53磷酸化從而正向調控豬睪丸細胞的增殖。Xu等[31]將Wip1基因敲除梅山公豬和野生型公豬分別與野生型梅山母豬雜交發現，敲除豬配種的母豬的妊娠率、仔豬總產仔數和活產仔數均顯著低于野生組。以上研究可為探索公豬繁殖能力提供新的著眼點。除了在小鼠和豬上的研究，Wip1基因在人類精子中也有表達，且Wip1基因正向調控精子濃度和精子DNA碎片指數，負向調控精子活力[32]，但具體機制有待深入解析。

Wip1基因通過動態平衡調節DNA損傷反應和去磷酸化作用來影響卵母細胞和胚胎發育，這為Wip1基因影響雌性動物的生殖提供了理論依據。Wip1基因通過影響卵母細胞的DNA損傷修復來調控生殖能力。Leem等[33-34]研究表明，抑制Wip1基因表達可顯著促進小鼠卵母細胞G2前期阻滯過程中DNA損傷修復，推測Wip1基因可能是小鼠卵母細胞減數分裂過程中DNA損傷修復的關鍵抑制因子；抑制Wip1基因可以恢復老化卵母細胞的DNA修復能力，防止卵母細胞質量惡化，提高老化卵母細胞的受精和發育能力。Tan等[35]研究證實，在人妊娠子癇前期的胎盤滋養層細胞凋亡過程中，Wip1基因與p38存在反饋調節回路，以維持在缺氧應激條件下的細胞穩態。Park等[36]研究表明，Wip1基因可通過調控Smad4酶去磷酸化影響動物胚胎發育。Wip1基因可以調節妊娠期的造血發育，能通過改變細胞周期狀態來調節胚胎造血過程中的造血干細胞前期成熟和增殖發育[13-14]，其作用機制可能是由mTORC1信號通路所致，這為Wip1基因如何在胚胎中調節造血干細胞功能做了初步探究。Zhou等[37]研究報道，Wip1蛋白的表達隨著小鼠日齡增長而下調，在體外培養3 d的新生小鼠卵巢中加入Wip1抑制劑發現，與對照組相比，加入抑制劑組的原始卵泡顯著減少；且抑制Wip1可通過激活p53-BAX-caspase-3途徑加速原始卵泡閉鎖，從而導致大量原始卵泡丟失，為了解卵巢老化過程中卵巢儲備功能下降提供了有價值的信息。

4 Wip1基因調控機體免疫功能

研究證實，Wip1基因通過調控機體免疫細胞(包括T細胞、B細胞和中性粒細胞)的功能，從而在機體先天免疫系統和適應性免疫系統中發揮重要影響。Wip1基因缺失小鼠表現出一些異常，如皮膚潰瘍、淋巴結異常增生、對病原體易感性增加，T細胞和B細胞功能低下等[23]。Wip1基因可正向調控T細胞發育和功能發揮。Schito等[38]研究發現，與野生型小鼠相比，Wip1基因敲除小鼠的胸腺髓樣上皮細胞的成熟明顯受阻，其原因可能為Wip1基因缺失使得p53活性升高，從而阻礙胸腺細胞雙陰性階段向雙陽性階段的進展，導致機體內T細胞數量明顯減少，影響胸腺正常功能發揮。Sun等[39]研究揭示，Wip1基因可通過抑制p38 MAPK信號通路，正調控髓質胸腺上皮細胞的成熟、穩態和再生，調節T細胞功能的正常發揮。然而，Martinikova等[40]研究表明，Wip1基因缺失與T細胞的分化無相關性，僅可能影響胸腺細胞DNA損傷修復。miR-16與p53和Wip1的信號通路反饋環也可調節T細胞凋亡[21]。Wip1基因調控的磷酸酶能夠減弱T細胞中DNA損傷修復反應，致使人外周血中的T細胞對凋亡敏感[41]。同時，Yi等[42]研究證實，Wip1基因正向調控B細胞發育和功能發揮，如Wip1基因敲除可能增強早期B細胞前體中p53依賴的凋亡信號通路，導致B細胞發育明顯受阻，使骨髓、外周血和脾臟中B細胞數量明顯減少。然而，在另一項有關Wip1基因敲除小鼠的研究中發現，脾臟中B細胞數量并無明顯變化，但引起B細胞和T細胞部分功能受損[23]。由此可見，Wip1基因在B細胞和T細胞發育過程中起著重要作用，但是具體的調控機制尚未完全解析，仍需進一步研究。

此外，Wip1基因負調控中性粒細胞發育和功能發揮。Liu等[43]研究發現，在骨髓前體分化為成熟中性粒細胞的過程中Wip1基因表達呈明顯上升趨勢，Wip1基因缺失可能通過調控p38 MAPK-STAT1信號通路導致中性粒細胞發育和成熟明顯增強。Sun等[44]研究發現，Wip1基因敲除小鼠炎癥部位的中性粒細胞增多且遷移能力增強，并且機體對金黃色葡萄球菌的殺菌活性增強，推測可能是由于中性粒細胞中p38 MAPK介導的趨化因子受體2(chemokine(C-X-C motif) receptor 2，CXCR2)內化和脫敏降低導致的。Wip1基因在中性粒細胞的發育和成熟過程中起著關鍵性的調節作用，能夠負向調節嗜中性粒細胞的遷移和炎癥，可能是膿毒癥治療的潛在靶點[45]。在炎癥性腸炎模型中，與野生組小鼠相比，Wip1基因敲除小鼠中促炎細胞因子和嗜中性粒細胞特異性標志物表達量顯著升高[46]。Uyanik等[47]研究揭示，可通過化學抑制或基因敲除方法導致Wip1基因失活，促進腫瘤細胞分泌可溶性因子，從而降低中性粒細胞的凋亡發生率，延長細胞的壽命。Liu等[43]研究也進一步發現，Wip1基因缺失增加了小鼠血液內中性粒細胞的數量，并改變中性粒細胞的形態。Wip1基因可以通過負調控對巨噬細胞的遷移及吞噬作用產生影響[48]，這可為防止動脈粥樣硬化斑塊的形成提供一種新的思路。鑒于Wip1基因在免疫反應中起著重要的作用，其與大動物疾病的關系如何，是否可以平衡炎癥引發的機體損傷，從而作為大動物抗病育種的靶點，值得深入探討。

動物體正常的生理活動中免疫系統起到了關鍵作用，而免疫炎癥與腫瘤發生又有著緊密的聯系。研究發現，Wip1基因可促進線粒體的氧化磷酸化途徑，增強巨噬細胞的自我更新能力，誘導腫瘤相關巨噬細胞向抑炎型巨噬細胞極化，進而促進腫瘤的發展[49]。Wip1基因在生殖細胞系中是一個DNA損傷應答(DNA-damage response,DDR)調節器，而DDR在癌癥中常不受管制，導致了基因組的不穩定性，在癌癥細胞中，腫瘤的進化可以從Wip1基因的致瘤作用和異染色質動力學、轉座因子表達以及可能增強異質性的易突變環境的關系展開研究[25]。

Wip1基因作為原癌基因也可通過抑制p38 MAPK、p53、ATM、Chk2和MDM2等分子參與的信號通路調控機體內腫瘤(包括乳腺癌、結直腸癌和腦癌等)發生。Pechackova等[50]研究發現，小分子抑制劑GSK2830371可有效抑制Wip1基因的表達，引起細胞周期阻滯或細胞凋亡，從而阻止乳腺癌細胞的生長和擴散。Liu等[51]研究報道，Wip1基因和miR-21同時缺失可抑制乳腺癌細胞的增殖、生存和致瘤潛力，從而降低機體內腫瘤的生長和擴散。Mahdavi等[52]研究證實，Wip1基因是乳腺癌易感基因，Wip1基因表達調控能夠增加遺傳性乳腺癌的發生率。Wang等[53]通過構建早期病變乳腺癌模型發現，抑制Wip1基因活性可阻礙p38-MK2-Hsp27信號通路發揮正常功能，從而限制乳腺癌細胞的早期擴散。另外，有研究報道，Wip1基因在結直腸癌組織中顯著高表達，可通過調控Wip1-KPNA2-Akt/GSK-3β和NF-κB-Wip1-mTOR-p21信號通路從而負調控抑癌因子p53表達，是引發結直腸癌發生的關鍵原因之一[54-56]。Burocziova等[57]通過構建Wip1基因突變小鼠模型發現，基因突變小鼠腸道細胞中的p53信號通路受到抑制，表現為促進結腸腫瘤生長并降低小鼠的存活率。Akamandisa等[58]在彌漫性固有橋腦膠質瘤細胞中發現，Wip1基因突變可抑制細胞DNA損傷修復，促進細胞凋亡。Wang等[59]研究表明，在彌漫性固有橋腦膠質瘤細胞中抑制Wip1基因表達能顯著抑制細胞內DNA損傷修復，降低細胞活力，增加細胞死亡率。研究發現，Wip1基因截短突變是新生彌漫性中線膠質瘤形成的致癌驅動因素[60]；Wip1基因截短突變在髓系腫瘤患者中顯著富集，會產生化療耐受的表型，導致Wip1基因突變型造血細胞在體內外選擇性擴增，且磷酸化蛋白質組學分析發現靶蛋白的磷酸化水平發生了變化，提示該突變可能影響了DDR反應等多條信號通路，在化療藥物的作用下，Wip1基因突變型細胞DDR反應受損導致細胞周期進程改變、凋亡減少、線粒體啟動減少[61]。Wip1基因通過下調促凋亡p53蛋白2，增強Wnt/β-catenin信號通路，調控腫瘤細胞的生長和轉移[62]，為研究Wip1基因對人胰腺癌的影響提供參考。也有研究報道，抑制Wip1基因表達可增加卵巢癌SKOV3細胞的凋亡，從而增強化療對癌癥的作用效果[63-64]。鑒于Wip1基因在腫瘤中的重要功能，將其作為治療癌癥的有效靶點有望成為新的研究方向。

5 小 結

Wip1基因通過調控相關因子或信號通路參與了動物機體內不同的生理和病理過程，但仍存在一些問題尚不明確：①雖然Wip1基因參與調控動物生殖發育，但其是否可以作為大動物繁殖性能相關的分子標記仍需大量研究；②Wip1基因在腫瘤發生發展過程中發揮著重要作用，而其抑制劑是否可應用于臨床也需深入探討；③Wip1基因調控機體生物學功能涉及到的一些關鍵調控機制和信號通路尚待進一步解析。因此，對這些問題展開深入研究，將有助于將Wip1基因應用于畜牧生產和臨床實踐，以便更好地改善動物的生產力和靶向基因治療的效果。