福建省漳州市羅非魚無乳鏈球菌分離鑒定及毒力基因和耐藥性研究

袁 橙，陳懷君，袁 圣，溫華茂，陳智怡，董洪燕，封 琦，郭長明

(1.江蘇農牧科技職業學院，泰州 225300；2.廣西大學動物科學技術學院，南寧 530004；3.福建恒興飼料有限公司，漳州 363108)

羅非魚養殖在國內發展迅速，已成為繼中國四大家魚之后的第五大養殖魚種。據《中國漁業統計年鑒2019》統計，2018年中國羅非魚淡水養殖產量為162.5萬t，比2017年增長4萬t。隨著養殖規模的擴大，羅非魚養殖環境管理和控制卻未能同步保障，導致每年7～10月份無乳鏈球菌病等頻繁暴發，制約了中國羅非魚養殖業的健康發展[1-3]。

無乳鏈球菌感染宿主范圍廣泛，不僅會引起魚類敗血癥、奶牛乳腺炎，而且能引發新生兒敗血癥、腦膿腫等嚴重疾病[4]。中國流行的無乳鏈球菌血清型主要為Ⅰa型[5]，其發病機制包括菌體黏附與侵襲細胞、菌體釋放毒素和宿主不適當的免疫應答等[6-7]。無乳鏈球菌的許多毒力因子與致病機制相關。當感染宿主時，病原菌選擇性表達的多種毒力因子共同配合引發疾病。已有研究證實，約30種毒力因子與無乳鏈球菌的致病性有關[8]。其中，cylE基因編碼的β-溶血素是無乳鏈球菌表面相關的多功能毒素，可促進細菌在宿主體內擴散，引起心臟、肝臟功能衰竭等；sodA基因編碼的超氧化物歧化酶有助于細菌適應宿主體內的氧化應激環境；gapC基因參與編碼的三磷酸甘油醛脫氫酶與無乳鏈球菌黏附宿主細胞有關；scpB基因編碼的C5a肽酶可分解和滅活人類補體成分C5a，幫助細菌逃避免疫系統的清除。目前魚無乳鏈球菌病尚無有效疫苗可用，多數養殖場應對該病的主要措施仍是投喂抗生素，導致魚源無乳鏈球菌耐藥性日趨嚴重。

為了解福建羅非魚主養區無乳鏈球菌病流行特征，江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室從福建省漳州市部分地區羅非魚養殖場分離無乳鏈球菌，通過對分離菌株進行血清型鑒定、主要毒力基因鑒定和藥敏試驗，以期明確福建羅非魚主養區無乳鏈球菌的生物學特性，為防治魚類無乳鏈球菌病提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2020年8月上旬，江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室從福建省漳州市某羅非魚養殖場采集泳姿異常(如翻滾式或呈原地轉圈式游動)，或出現眼球突出混白等癥狀羅非魚的腦組織、眼球內容物、肝臟等作為待檢病料。

1.2 主要試劑

無菌綿羊血購自南京鼎周生物科技有限公司；THB培養基購自BD公司；瓊脂粉購自OXOID公司；細菌基因組提取試劑盒、DNA純化試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；DL2000 DNA Marker、PCR 2×TaqMix均購自南京諾唯贊生物技術有限公司；藥敏紙片和生化反應管均購自杭州濱和微生物試劑有限公司；其余試劑為進口或國產分析純。

1.3 細菌分離培養與形態學觀察

取病魚腦組織、眼球內容物及肝臟組織，劃線接種于TSB血平板進行細菌分離，37 ℃過夜培養，次日觀察菌落形態及溶血特性。挑取白色、表面光滑濕潤、邊緣整齊的優勢菌單菌落接種TSB液體培養基，37 ℃培養至對數生長期，取適量菌液進行革蘭染色，用油鏡對分離株進行形態學觀察。

1.4 分離株的生化鑒定

從分離株純培養物中挑取單個典型菌落，參照生化反應管說明書進行VP試驗、CAMP試驗、觸酶試驗、海藻糖和山梨醇發酵試驗、馬尿酸鹽和七葉苷水解試驗。

1.5 細菌分子生物學鑒定

1.5.1 菌株PCR鑒定 將生化鑒定為陽性的分離株在THB血平板上進行三區劃線純化菌株，37 ℃培養18 h后，挑取單菌落于THB液體培養基中，置于搖床180 r/min、37 ℃恒溫培養至對數生長期。利用菌液PCR快速檢測陽性菌株。根據文獻[9]合成無乳鏈球菌16S rDNA特異性片段引物(上游引物：5′-GAGTTTGATCATGGCTCAG-3′;下游引物：5′-ACCAACATGTGTTAATTACTC-3′)，引物由蘇州金唯智生物技術有限公司合成。PCR反應體系15 μL：菌液 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×TaqMix 7.5 μL，ddH2O 3.5 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共34個循環；72 ℃延伸5 min。反應結束后進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5.2 細菌DNA提取 將PCR檢測陽性菌株分別接種于8 mL THB培養基中，置于搖床180 r/min、37 ℃恒溫培養6 h。按細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細菌基因組DNA，并保存于-20 ℃，用于16S rDNA通用引物PCR進一步鑒定。

1.5.3 分離菌株16S rDNA鑒定 根據文獻[10]合成細菌16S rDNA通用引物(上游引物：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCA-3′；下游引物：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)，引物由蘇州金唯智生物技術有限公司合成。PCR反應體系50 μL：DNA模板 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，2×TaqMix 25 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應條件同1.5.1。序列預期擴增長度為1 500 bp。取2 μL擴增產物進行1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。用DNA純化試劑盒對符合預期條帶的部分擴增產物進行純化，寄送蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序。

1.6 分離株血清型鑒定

參照Imperi等[11]基于莢膜多糖基因序列設計的無乳鏈球菌血清型鑒定引物，合成19條特異性引物(表1)，引物均由蘇州金唯智生物技術有限公司合成。以無乳鏈球菌參考菌株人源株NEW316、牛源株ATCC 13813、魚源株GD201008-001作為陽性對照，多重PCR鑒定分離株的血清型。

從歷史來看，15世紀的西方人充滿了一種敢于冒險的精神，以超乎尋常的方式探索著未知的世界。葡萄牙人航海探險的規模雖然難以與東方世界鄭和下西洋的規模相比較，但它也是那個歷史性的時刻，一個海上技術與通道迅速發展、連接整個世界的時刻，一個西方亨利王子緊抓機遇、東方皇帝拒絕機遇的時刻，成了決定西方主宰世界的時刻。西方的冒險迸發了諸類治理文明，而這些文明又迅速擴展，成為其主宰世界的有力工具。

PCR反應體系20 μL：DNA模板 1μL，2×TaqMix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O補至20 μL。PCR反應條件同1.5.1。反應結束后取2 μL產物進行1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 分離株毒力基因的檢測

為檢測分離菌株的主要毒力基因，根據文獻[12]合成4個無乳鏈球菌主要毒力基因SodA、cylE、gapC和scpB引物，引物信息見表2。以無乳鏈球菌參考菌株人源株A909、牛源株ATCC13813、魚源株GD201008-001作為陽性對照，同時以ddH2O為模板做陰性對照，分別PCR擴增以上4種毒力基因。PCR反應體系15 μL：細菌基因組DNA 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×TaqMix 7.5 μL，ddH2O 3.5 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性15 s，退火(溫度見表2)15 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環；72 ℃延伸5 min。反應結束后，取2 μL產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表2 毒力基因檢測引物

1.8 藥敏試驗

根據美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)推薦的K-B法，測定各分離株對29種抗菌藥的敏感性。取150 μL新鮮的目的菌液涂于直徑90 mm的THB平板，貼藥敏片后37 ℃恒溫培養15 h左右，測量抑菌圈直徑。依據抑菌范圍說明書進行藥敏結果判斷。

2 結 果

2.1 臨床癥狀

病魚表現為食欲減退，游動姿勢不平衡或呈圈樣打轉，眼球突出腫大，眼角膜渾濁，眼眶四周輕微出血。剖檢各臟器伴有不同程度的水腫，病魚肝臟腫大并呈纖維素樣變，膽囊腫大、顏色較深、膽汁充盈。

2.2 形態學觀察

將分離菌株劃線接種血瓊脂平板，37 ℃培養24 h后，菌落特征為：白色圓形、邊緣整齊、表面光滑濕潤，呈β溶血(圖1)。革蘭染色后，油鏡下分離株為典型的革蘭陽性球菌特性，菌體呈藍紫色，菌體排列為長短不一的鏈狀，單個或成對存在(圖2)。共分離獲得14株分離菌。

圖1 分離株菌落特征

圖2 分離株革蘭染色鏡檢圖(1 000×)

2.3 生化鑒定結果

生化鑒定結果發現，14株分離株VP試驗、CAMP均為陽性，觸酶試驗陰性，能發酵海藻糖，不能分解山梨醇和馬尿酸鹽，七葉苷水解試驗均為陰性，符合無乳鏈球菌的生化特性。

2.4 特異性片段PCR擴增及16S rDNA鑒定結果

將生化試驗鑒定陽性的14株分離菌株用特異性片段引物均擴增出大小為220 bp的目的條帶，部分分離株特異性片段引物快速鑒定結果見圖3。

M,DL2000 DNA Marker;1,GD201008-001;2,陰性對照;3～9,部分分離菌株。圖4同

以各細菌基因組DNA為模板，16S rDNA通用引物擴增結果顯示，獲得大小為1 500 bp的目的片段(圖4)，與預期的條帶大小相符，測序結果經BLAST比對，與無乳鏈球菌相似度高于99%，進一步證實14株分離菌株均為無乳鏈球菌。

圖4 部分分離株16S rDNA PCR鑒定

2.5 血清型鑒定

以已知血清型的參考菌株GD201008-001、ATCC 13813、NEW316為陽性對照，采用多重PCR鑒定目的菌株的血清型，結果見圖5。由圖5可知，所有分離菌株的血清型均為Ⅰa型，與陽性對照菌株GD201008-001一致，呈現2個目的條帶680和270 bp。

M，DL2000 DNA Marker;1，GD201008-001(血清Ⅰa型);2，ATCC 13813 (血清Ⅱ型);3，NEW316 (血清Ⅲ型);4，陰性對照;5～18，分離菌株

2.6 主要毒力基因的檢測

以已知毒力基因的參考菌株GD201008-001、ATCC 13813、A909為陽性對照，擴增各分離菌株的主要毒力基因。cylE(697 bp)、sodA(528 bp)及gapC(222 bp)3種毒力基因的檢出率為100%。14株分離菌株均未檢測出毒力基因scpB(1 270 bp)，該毒力基因僅在參考菌株人源無乳鏈球菌A909中檢出。部分菌株毒力基因檢測結果見圖6。

①A～D，分別為毒力基因cylE、sodA、gapC和scpB。②M，DL2000 DNA Marker;1，GD201008-001;2，ATCC 13813；3，A909;4，陰性對照;5～11，部分分離株

2.7 藥敏試驗結果

由表3可知，14株分離菌株對甲氧胺嘧啶、磺胺異噁唑、氟羅沙星、多黏菌素B及氨基糖苷類藥物敏感率為0，且耐藥率均達50%以上。但對氯霉素類、β-內酰胺類、大環內酯類、利福霉素類、林可胺類藥物的敏感性為100%。

表3 分離菌株藥物敏感性試驗結果

2.8 多重耐藥分析

由圖7可知，14株分離菌株均呈多重耐藥現象，耐藥數量為4到8重，其中6重及以上耐藥的菌株11株，占總分離菌株數的78.57%。

圖7 分離株多重耐藥分析結果

3 討 論

從福建省漳州市部分漁業養殖場采集眼球混白突出、眼眶輕微出血、游動姿勢呈圈樣打轉或偏向一側等病癥的羅非魚病料，從病魚的腦、肝臟和眼部分離病原菌。純化結果發現，分離菌菌落在THB血平板上為圓形乳白色，表面光滑，呈β溶血。由16S rDNA特異性片段引物初步鑒定及16S rDNA通用引物擴增后測序比對，共獲得14株無乳鏈球菌。

研究表明，魚源、人源和牛源無乳鏈球菌分子血清型主要包含Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ型3種[13-14]。國內分離菌株的血清型主要為Ⅰa型，Ⅰb和Ⅲ型較少。對14株分離菌株的血清型進行鑒定，發現血清型均為Ⅰa型，與對照菌株GD201008-001相同。此次在福建地區分離得到的菌株血清型，與江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室同期在海南、廣西地區分離得到的無乳鏈球菌血清型相同[15-16]，均為Ⅰa型。方偉等[17]研究顯示，廣東省部分羅非魚養殖區感染的無乳鏈球菌血清型均為Ⅰa型，與本試驗結果一致，進一步證實國內羅非魚無乳鏈球菌的優勢血清型是Ⅰa型。

無乳鏈球菌中多種毒力因子作用于機體，導致宿主產生一系列病癥。本研究檢測的毒力基因包括cylE、sodA、gapC和scpB，檢測結果與江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室同期在福建、海南、廣西3個地區分離獲得的76株無乳鏈球菌主要毒力基因檢測結果完全吻合，這些分離株均含毒力基因cylE、sodA和gapC，而缺少毒力基因scpB[15-16]。馬芳等[18]檢測結果顯示,分離株血清型也均為Ⅰa型，同時gapC和cylE基因陽性；Kayansamruaj等[19]研究顯示，cylE基因陽性率為100%，但scpB基因序列在Ⅰa 型無乳鏈球菌的基因組中不存在。以上國內相關研究成果均與此次研究符合，提示scpB基因可能不是Ⅰa 型羅非魚無乳鏈球菌的主要毒力基因，所以檢出率低。

研究發現，福建地區無乳鏈球菌對β-內酰胺類、氨芐青霉素、強力霉素、四環素等藥物敏感，此結果與王巧煌[20]研究結果一致。謝?；╗21]研究顯示，福州地區無乳鏈球菌對青霉素G、氨芐青霉素、萬古霉素有較高的敏感率，與本研究結果相符。將此次福建地區藥敏結果與江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室分離得到的海南、廣西地區無乳鏈球菌的藥物分析結果進行比較[15-16]，3個地區的分離菌株均對磺胺異噁唑、慶大霉素、鏈霉素、新霉素4種藥物表現高耐藥率，對紅霉素、利福平、克林霉素、β-內酰胺類藥物的敏感率高。福建、海南和廣西3個地區分離株的不同之處包括：①福建、廣西地區菌株還對卡那霉素有較強的耐藥性，但海南地區菌株對卡那霉素敏感性高達93%；②海南地區菌株對復方新諾明呈現高耐藥率，但福建、廣西地區菌株對該藥敏感性較強。以上對比結果顯示，3個地區的漁業養殖戶對抗生素的選用大致相似，進一步分析造成3個地區分離株耐藥性差別的原因可能有：①3個地區的分離株有不同的遺傳背景，對某些藥物的敏感度不同[22-24]；②部分養殖戶長期使用某種藥物，病原菌毒力基因、耐藥基因的表達可能發生變化，誘導病原菌耐藥性的產生，造成抗生素“失效”；③養殖環境的差異，如水體硬度、pH及金屬離子的含量等[25]，這些因素均對藥效有一定影響。明確各地的無乳鏈球菌的耐藥規律，對指導用藥、制定合理防控措施具有重要的指導意義。

調研和采樣中發現，許多羅非魚養殖戶一味追求提高養殖密度，忽視養殖環境控制，使魚體長期處于應激狀態、免疫力下降，感染細菌性疾病的風險增加。規范養飼養管理，保障水產品質量安全迫在眉睫[26]。當前，使用抗生素仍是控制羅非魚無乳鏈球菌病的主要手段，養殖戶應提高科學用藥意識，通過藥敏試驗篩選國家允許使用的有效藥物，精準治療羅非魚鏈球菌病。隨著漁用抗生素禁用種類的不斷增加，尋找替代抗生素療法對防治羅非魚無乳鏈球菌病也有重要意義，如研制疫苗、使用抗菌肽及中草藥防治方法等[27-29]。

4 結 論

本研究從福建省漳州市發病羅非魚中分離獲得14株無乳鏈球菌，血清型均為Ⅰa型。毒力基因cylE、sodA、gapC檢出率均為100%，未檢出毒力基因scpB。14株分離菌株均呈多重耐藥，磺胺異噁唑、慶大霉素、卡那霉素等耐藥率>70%，氯霉素類、β-內酰胺類、大環內酯類等敏感率為100%。