蛹蟲草培養殘基中蟲草素的水熱回流提取及含量測定

彭志蘋，張景艷，郭志廷，王 磊，張 凱，張 康，王貴波，仇正英，王學智，李建喜

(中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省中獸藥工程技術研究中心，蘭州 730050)

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris(Linn.) Link.)又稱北蟲草、蛹草、蛹草菌，為麥角菌科蟲草屬，性平味甘，入肺、腎二經，具有補精益髓、潤肺補腎、止咳化痰等功效[1-2]。研究證明，蛹蟲草與冬蟲夏草的化學成分和藥理作用相似，具有降血糖、降血脂、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗氧化和免疫調節等藥理作用[3-5]。蛹蟲草最初發現于自然界，目前已實現了規模化人工培養，以固體培養方式為主，培養基由大米、小麥、高粱等組成，子實體采摘后，會剩余大量培養殘基[6]。這些培養殘基長滿菌絲體，內含子實體相同的蟲草素、蟲草多糖等有效成分，具有二次開發利用價值。實際生產中，蛹蟲草培養殘基開發利用較少，大部分被丟棄，造成了資源浪費和環境污染，因此迫切需要開展其有效成分的提取研究[7]。據報道，蛹蟲草活性成分提取方法主要有水熱回流法、浸提法、醇熱回流法、超聲波法、超聲波輔助酶提取法等[8-9]，其中水熱回流法提取工藝簡單，具有不使用有機溶劑、成本低、便于規模化生產等優點。雖然，王英娟等[10]和雷燕妮等[11]分別將水熱回流法用于蛹蟲草子實體和菌渣中有效成分提取，建立了相關工藝流程和參數，但因蛹蟲草培養基配方存在差異，針對不同培養殘基中有效成分提取的相關參數還需進一步篩選與優化。影響水熱回流法提取中藥有效成分的主要因素包括粉碎粒度大小、提取溫度、提取時間、提取次數和液料比等[12]。鑒于此，本研究以液料比、提取次數、提取溫度、提取時間4個因素進行單因素試驗和正交試驗，優化水熱回流法提取蛹蟲草培養殘基蟲草素的工藝，并利用高效液相色譜測定法(high-performance liquid chromatography，HPLC)對提取物中蟲草素含量進行驗證，以期為蛹蟲草培養殘基深入研究和開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

蛹蟲草培養殘基由山東奧美生物工程有限公司提供。蟲草素標準品(純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司)；腺苷標準品(純度≥99%，上海源葉生物科技有限公司)；乙腈、甲醇(色譜純，賽默飛世爾科技(中國)有限公司)。

U-3000高效液相色譜儀(戴安中國有限公司)；KQ-600DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；LGJ-10F真空冷凍干燥機(北京松源華興科技發展有限公司)；ZNCLT-500系列磁力攪拌器(上海瑞茲儀器設備有限公司)；CS-2000高速多功能粉碎機(永康市天祺盛世工貿有限公司)；Allegra X-15R貝克曼臺式冷凍離心機(貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司)。

1.2 蛹蟲草培養殘基提取工藝流程

蛹蟲草培養殘基經粉碎后過40目篩，稱取適量粉末于三口燒瓶中，按相應比例加入蒸餾水，置電熱套上，加熱回流，室溫冷卻后4 000 r/min離心10 min，取上清液，沉淀按相同程序重復提取。合并上清液，攪拌濃縮至200 mL，冷卻至室溫后―80 ℃預凍，真空冷凍干燥后備用。

1.3 HPLC測定提取物中蟲草素含量

參照行業標準NY/T 2116—2012蟲草制品中蟲草素和腺苷測定[13-14]。

1.3.2 供試品溶液制備 精密稱取0.0500 g樣品于容量瓶中，加適量超純水溶解，超聲30 min，定容至10 mL。取1 mL樣液過0.45 μm微孔濾膜，濾液供HPLC測定。

1.3.3 標準曲線繪制 精密稱取蟲草素和腺苷標準品各2.50 mg，超純水溶解，定容至25 mL，搖勻。該混合標準儲備液中蟲草素和腺苷的質量濃度均為100 mg/L，4 ℃保存。分別準確取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 mL混合標準溶液于10 mL容量瓶中，超純水定容至10 mL，濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0 mg/L。依據色譜測定條件，以蟲草素質量濃度為橫坐標、相應峰面積為縱坐標制作標準曲線。

1.3.4 精密度 吸取1 mL供試品溶液，在相同色譜條件下，連續進樣6次，計算峰面積測量值相對標準偏差(RSD)，RSD≤2%。

1.3.5 重復性 分別制備供試品溶液6份，在相同色譜條件下各進樣1次，計算峰面積測量值RSD，RSD≤2%。

1.3.6 穩定性 吸取1 mL供試品溶液，在相同色譜條件下，于0、2、4、6、8、10、12、18和24 h各進樣1次，計算峰面積測量值RSD，RSD≤2%。

1.3.7 準確度 分別制備供試品溶液9份，每份準確吸取5 mL供試品溶液于10 mL容量瓶，分別按照標準品加入量與所取供試品中待測成分量1.5∶1、1∶1、0.5∶1配制，得到濃度分別為150%、100%、50%(M/M)溶液，每個濃度重復3次。在相應色譜條件下分別進樣1次，計算回收率。

回收率(%)=(供試品實測成分量―供試品原成分量)/對照品加入量×100%

以護理前后ADL評分、FMA評分為評比項進行對比。日常生活活動能力（ADL）評分，總分100分，＞61分表示日常生活活動能力有輕度的功能損害，41～60分表示中度損害，＜40分表示重度損害。簡式Fugl－Meyer評測法（FMA）評分，進行上肢、下肢運動功能的評定，運動功能程度與分數呈正相關。

1.3.8 結果計算 按照保留時間定性，樣品與標準品保留時間RSD≤2%，多點校正外標法定量。根據線性回歸方程計算樣品質量濃度(mg/L)，試驗樣品中蟲草素含量以質量分數ω計，單位以mg/g表示，按以下公式計算。

ω=ρ×V×m2/(m1×M×1000)

式中，ρ，供試品中蟲草素質量濃度(mg/L)；V，供試品最終體積(mL)；m1，供試品質量(g)；m2，水提物的質量(g)；M，蛹蟲草培養殘基的質量(g)。

1.4 單因素考察蛹蟲草培養殘基提取工藝

按照1.2方法分別考察液料比、提取次數、提取溫度和提取時間對蛹蟲草培養殘基提取工藝的影響。各因素考察水平如下：液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1)、提取次數(1、2、3、4、5次)、提取溫度(60、70、80、90、100 ℃)、提取時間(30、60、90、120、150 min)，按照1.3方法測定各因素水平下蟲草素含量，每個水平重復3次。

1.5 正交試驗優化蛹蟲草培養殘基提取工藝

在單因素試驗基礎上，利用正交試驗對提取工藝進行進一步優化。選用L9(34)正交設計模型，選擇4個因素：液料比(A)、提取次數(B)、提取溫度(C)、提取時間(D)，各因素間不考慮交互作用，每個因素各有3個水平(表1)。分別取9份10.0 g蛹蟲草培養殘基，按1.2和1.3方法提取并測定提取物中蟲草素含量，每個處理重復3次。

表1 影響蛹蟲草培養殘基提取的因素及水平

1.6 提取回收率試驗

分別稱取2.0 g已知含量的蛹蟲草培養基12份，按照蟲草素對照品加入量與所取供試品中待測成分量之比1.5∶1、1∶1、0.5∶1、0∶1配制，得到濃度分別為150%、100%、50%、0(W/W)的溶液，每個濃度重復3次，根據正交試驗結果確定的提取工藝制備供試品溶液。在相應色譜條件下分別進樣1次，計算回收率及RSD。

1.7 數據統計分析

采用SPSS 26.0統計軟件中單因素方差分析和正交設計方差分析進行數據統計處理，數值以平均值±標準差表示。P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 方法學考察

2.1.1 系統適應性 各取3份混合對照品溶液、蛹蟲草培養殘基供試品溶液和空白溶劑，分別開展HPLC試驗，結果見圖1。由圖1可知，樣品中蟲草素的分離度和理論塔板數良好，分離度>1.5，理論塔板數>12 000，不對稱因子在1.00～1.20之間，且沒有陰性干擾。

圖1 混合標準品(A)、供試品(B)和空白溶劑(C)的HPLC色譜圖

2.1.2 線性范圍 以蟲草素質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，結果見圖2。由圖2可知，蟲草素的線性回歸方程為：y=0.6888x-0.1629，R2=0.9999。表明蟲草素質量濃度在1.00～100 mg/L范圍內線性相關性良好。

圖2 蟲草素的標準曲線

2.1.3 精密度、重復性和穩定性 由表2可知，同一供試品溶液重復測定6次，結果顯示，蟲草素峰面積為18.75 mAU*min，RSD為0.85%，表明儀器精密度良好；同一批次的6個供試品溶液各測定1次，結果顯示，蟲草素峰面積為18.72 mAU*min，RSD為0.46%，表明方法重復性良好；同一供試品溶液分別于0、2、4、6、8、10、12、18和24 h時各測定1次，結果顯示，蟲草素峰面積為18.43 mAU*min，RSD為1.71%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

表2 HPLC方法的精密度、重復性和穩定性測定

2.1.4 準確度 取50%、100%、150%的供試品溶液，在相應的色譜條件下各測定1次，計算加樣回收率，結果顯示，加樣回收率為103.55%，RSD為2.64%(表3)，表明該方法準確度良好。

表3 HPLC方法的準確度測定

2.2 單因素試驗

2.2.1 液料比 由圖3A可知，隨著液料比的增加，蟲草素含量呈先上升后下降趨勢。在液料比為20∶1時，蟲草素含量達到最高，為1.32 mg/g，顯著高于液料比5∶1和10∶1(P<0.05)，與液料比15∶1和25∶1時差異不顯著(P>0.05)。故選擇20∶1為最佳液料比，確定正交設計中液料比的3個水平分別為15∶1、20∶1和25∶1。

2.2.2 提取次數 由圖3B可知，蟲草素含量隨著提取次數增加而增加。在提取5次時，蟲草素含量最高，為1.34 mg/g，顯著高于提取1、2和3次(P<0.05)，與提取4次差異不顯著(P>0.05)。故選擇5次為最佳提取次數，確定正交設計提取次數的3個水平分別為3、4和5次。

2.2.3 提取溫度 由圖3C可知，蟲草素含量隨著提取溫度增加而下降，至90 ℃時蟲草素含量最低；提取溫度為70 ℃時，蟲草素含量最高，為1.22 mg/g，顯著高于90 ℃(P<0.05)，與其他3個提取溫度均差異不顯著(P>0.05)。故選擇最佳提取溫度為70 ℃，確定正交設計中提取溫度的3個水平分別為60、70和80 ℃。

2.2.4 提取時間 由圖3D可知，蟲草素含量在不同提取時間均無顯著差異(P>0.05)。在提取時間為60 min時，蟲草素含量最高，為1.11 mg/g。故選擇最佳提取時間為60 min，確定正交設計中提取時間的3個水平分別為60、90和120 min。

肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)

2.3 正交試驗設計結果

在單因素試驗基礎上，對液料比(A)、提取次數(B)、提取溫度(C)、提取時間(D)4個因素進行正交試驗。由表4的極差分析可知，在選定的試驗范圍內，影響蟲草素含量的因素主次順序為：提取時間>提取次數>液料比>提取溫度，因素水平的最佳參數組合為A3B3C1D1。由表5的方差分析可知，提取時間和提取次數對蟲草素含量有顯著影響(P<0.05)，提取溫度和液料比對蟲草素含量影響不顯著(P>0.05)。表明影響蟲草素含量的因素水平的最佳參數組合為B3D1，即最佳提取次數5次、提取時間60 min，液料比和提取溫度對提取工藝影響較少。綜合單因素試驗和正交試驗的結果，確定最佳提取工藝參數的液料比為25∶1、提取次數為5次、提取溫度為70 ℃和提取時間為60 min。

表4 正交設計的試驗結果及極差分析

表5 正交設計的方差分析

2.4 提取回收率試驗

由表6可知，在最佳提取條件下，測得蛹蟲草培養殘基中蟲草素含量為1.48 mg/g；50%、100%、150%的供試品溶液在相應的色譜條件下各進樣1次，結果顯示，蟲草素的平均提取回收率為92.56%，RSD為4.54%，表明蛹蟲草培養殘基的提取工藝良好。

表6 提取回收率測定

3 討 論

蛹蟲草培養殘基與其子實體一樣，含有蟲草素、腺苷、蟲草酸、蟲草多糖、超氧化物歧化酶、類胡蘿卜素、凝集素、纖維蛋白溶解酶等多種有效成分，其中蟲草素和蟲草多糖關注度最高[4,15]。研究發現，采用柱層析方法對蛹蟲草培養殘基進行提取、分離和純化，成功制備出高純度的蟲草素[16]。本試驗使用的蛹蟲草培養殘基原料為燕麥，內含大量淀粉類物質，這些物質在提取過程中會被分解為多糖，從而干擾蟲草多糖測定，因此一般以檢測提取物中蟲草素含量作為評價蛹蟲草培養殘基提取工藝的指標。蟲草素的測定方法主要有分光光度法、薄層色譜掃描法和HPLC法等[17]。分光光度法和薄層色譜法操作簡單、成本低，但檢測結果重復性差、誤差大；HPLC法具有重現性好、測定結果準確、靈敏度高、受樣品基質影響小等優點，是目前測定蟲草屬中蟲草素含量最常用的方法[17-18]。本研究參照行業標準[13]，驗證了蛹蟲草培養殘基水提物中蟲草素含量的HPLC測定方法，考察了該方法的專屬性、系統適用性、線性范圍、精密度、重復性、穩定性和準確度，結果顯示，蟲草素質量濃度在1.00～100 mg/L范圍內線性相關性高，結果穩定可靠，方法簡單，靈敏度高，這與李劍梅等[19]研究結果相近，表明該方法適用于蛹蟲草培養基中目標樣品的檢測。

中藥的現代提取方法包括超聲波法、加速溶劑萃取法、超高壓萃取法等，具有溶劑消耗少和提取時間短等優點，但技術含量需求高、成本也高[8]，不易推廣普及。因此，中小企業更愿意選擇工藝流程簡單、成本低的傳統提取方法，如浸提法和水熱回流法等[8]。中藥提取方法的選擇，還與提取物有效成分的極性有關。研究發現，蟲草素易溶于水、甲醇和熱乙醇，不溶于氯仿和乙醚等[20]；蟲草多糖易溶于水，難溶于有機溶劑和高濃度乙醇[21]，故常用水和乙醇為提取溶劑。Luo等[22]比較了水熱回流法和超聲提取法提取蛹蟲草子實體的蟲草素，發現水熱回流法的蟲草素提取率(95.02%)略低于超聲提取法(96.12%)。雷燕妮等[11]分別選用水和乙醇為提取溶劑，比較了熱回流法和超聲波輔助提取法對蛹蟲草菌渣中蟲草素、蟲草多糖和蛋白質得率的影響，結果發現，水熱回流法既可提取蛹蟲草菌渣中蟲草素，又可提取蟲草多糖和蛋白質。水熱回流法與超聲提取法相比，具有操作簡單和成本低等優點，但其提取率受提取物粒徑大小、溫度、時間、提取次數、液料比等提取因素的影響[11,23]。因此，學者們采用水熱回流法時常常會對提取工藝進行優化。本試驗結果表明，提取時間和提取次數對蟲草素含量的影響顯著，而液料比和提取溫度影響不顯著，其中影響程度依次為提取時間、提取次數、液料比和提取溫度。常正姣[24]采用單因素結合響應面法優化雜糧蛹蟲菌絲共生體的水浴提取條件，發現影響蟲草素含量的3個因素主次順序為浸提時間、液料比、浸提溫度，與本試驗研究結果相近。孟勝楠[25]采用水熱浸提法提取蛹蟲草小麥培養基，結果顯示，在提取溫度63.3 ℃、提取時間4.8 h、液料比36.8∶1、提取液pH 6.7時，提取物中蟲草含量最高，為1.32 mg/g。張麗艷[26]采用水熱浸提法提取蛹蟲草大米培養基，結果顯示，在提取溫度40 ℃、提取次數4次、液料比為20∶1、提取時間2 h時，提取物中蟲草素得率最高，為0.69%。本研究通過單因素試驗和正交試驗，確定的蛹蟲草培養殘基中蟲草素的最佳提取工藝參數為液料比25∶1、提取次數5次、提取溫度70 ℃、提取時間60 min，此條件下測得蟲草素含量為1.48 mg/g，高于孟勝楠[25]研究結果。提取回收率試驗結果顯示，在該工藝下蟲草素回收率為92.56%，表明該提取工藝參數穩定，結果準確可靠。

此外，蛹蟲草培養殘基提取方式不同，蟲草素含量也會有一定差異。陳麗冰[7]分別用超高壓提取法、超聲波水提取法和閃式提取法提取北蟲草培養基有效成分，結果顯示，北蟲草培養基中蟲草素含量分別為1.70、1.58和1.65 mg/g。石浩[27]比較了熱水-乙醇提取法、酸溶劑提取法、超聲協同酸溶劑提取法、超聲協同微波提取法對蛹蟲草下腳料超微粉的提取效果，結果顯示，蟲草素含量分別為2.70、2.86、3.18和2.94 mg/g，與本試驗結果有一定差異，原因可能在于：蛹蟲草培養基中菌絲共生體含量不同[24]；蛹蟲草培養殘基粉末粒度大小對蟲草素得率影響較大[27]。由此可見，蛹蟲草的培養基組方不同、菌絲共生體含量不同、培養方式不同，其有效成分的提取方法也應不同，水熱回流法是最常用方法之一。本研究確定的蛹蟲草培養殘基水熱回流法提取工藝參數穩定，活性成分得率好，可為后續蛹蟲草培養基水提物產品開發提供參考。

4 結 論

以蟲草素含量為評價指標，通過單因素試驗和正交試驗對液料比、提取次數、提取溫度和提取時間4個因素考察，得出蛹蟲草培養殘基活性成分的水熱回流法最佳提取工藝參數為：液料比25∶1、提取次數5次、提取溫度70 ℃、提取時間60 min，該條件下測得蟲草素含量為1.48 mg/g。