活化Nrf2緩解熱應激致肉雞心肌細胞氧化損傷的研究

武亞南，石玉祥，張永英，劉冠慧，宋偉光，鐘翠紅，王永霞

(1.河北工程大學生命科學與食品工程學院，邯鄲 056038;2.晨光生物科技有限公司，邯鄲 056038)

由于自身生理特點及現代集約化養殖模式，肉雞極易發生熱應激。熱應激可引發肉雞心肌細胞氧化損傷,影響肉雞心臟的正常功能，降低肉雞生產性能，增加肉雞猝死綜合征和肉雞腹水綜合征的發病率，給肉雞養殖業帶來巨大的經濟損失[1-2]。肉雞在高溫環境中，血液循環加快，心臟負擔加重，心肌細胞內超氧化物歧化酶(SOD)等代謝酶受高溫影響活性下降，引起氧化系統和抗氧化系統失衡[3]。過量的氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，導致脂質氧化終產物丙二醛(MDA)大量積累，損傷線粒體膜和細胞膜[4]。此外，在熱應激狀態下，心肌細胞線粒體的氧化磷酸化效率逐漸降低，鈣-腺苷三磷酸酶活性和鈣含量也降低，線粒體膜通透性轉換改變，進而導致細胞色素C釋放到細胞質,激活凋亡蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3),引起心肌細胞損傷[5]。血紅素氧合酶-1(HO-1)過表達可通過穩定線粒體膜和減少氧化產物生成緩解H9c2心肌細胞缺氧復氧損傷[6]。陳洪博等[7]研究表明，熱應激引起肉雞心肌細胞MDA含量增加，細胞培養液中乳酸脫氫酶(LDH)活性增強,SOD活性顯著降低，心肌細胞產生氧化損傷。

核因子紅系2相關因子2(Nrf2)信號通路在細胞抗氧化應激反應中發揮中樞調控作用[8],是治療心肌疾病、心功能障礙及抗心肌細胞氧化損傷的重要藥物靶點[9]。SIRT1(sirtuins家族中負責調控細胞蛋白質去乙酰化的酶)通過調控Nrf2蛋白去乙酰化激活Nrf2信號通路，促進通路下游HO-1和NAD(P)H∶醌氧化還原酶1(NQO1)的表達，提高心肌細胞的抗氧化能力，減少LDH的釋放，減輕心肌細胞缺氧/復氧所造成的氧化損傷[10]。近年來，Nrf2信號通路調控熱應激誘導畜禽氧化損傷機制的研究也越來越多[11-12]。Zhang等[13]研究發現,姜黃素可通過激活Nrf2信號通路上調熱應激肉雞肝臟中谷氨酰半胱氨酸連接酶(GCLC)和HO-1基因的轉錄水平增強肉雞抵抗熱應激損傷的能力。王換換等[14]研究表明，高溫可激活奶牛肝臟Nrf2信號通路，上調HO-1、GCLC和NQO1基因表達，從而頡頏熱應激誘導的奶牛肝臟氧化損傷。但鮮見有關激活Nrf2信號通路是否能夠緩解熱應激誘導的肉雞心肌細胞氧化損傷的報道。本試驗通過構建肉雞心肌細胞熱應激氧化損傷模型，用Nrf2特異性激活劑叔丁基對苯二酚(TBHQ)預活化Nrf2，探索激活Nrf2信號通路對熱應激肉雞心肌細胞氧化損傷的緩解作用，旨在為預防家禽熱應激提供新思路和有效分子靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM/F12、胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；Ⅱ型膠原酶購自上海源葉有限公司；5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Brdu)、雙抗(青、鏈霉素)、TBHQ、四甲基偶氮唑藍(MTT)、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SOD、LDH、MDA檢測試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；Nrf2和HO-1多克隆抗體購自Proteintech Group,Inc.；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG購自Abcam公司；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒、HiScript Ⅲ型RNA反轉錄試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 原代心肌細胞的制備

參照秦士貞[15]方法制備肉雞原代心肌細胞。無菌取出10日齡肉雞雞胚的心臟，冷D-PBS洗3～5次，眼科剪剪碎心臟組織后，用冷D-PBS洗滌至透明。棄上清液，加約5倍體積于心臟組織的0.12%膠原酶Ⅱ，于37 ℃水浴鍋中消化8 min，第一次消化液棄之不用。再次加入消化液在同等條件下繼續消化8 min，將消化液轉移至另一無菌試管中并加入等量培養基終止消化。按照前述方法重復消化5～6次直至沒有明顯的組織塊。用500目細胞篩網過濾2次，去除組織塊。收集所有消化液，800 r/min離心10 min，棄上清液，用培養基重懸。在37 ℃、5%CO2培養箱中進行2次差速貼壁培養(差速貼壁時間為1.5 h)，去除成纖維細胞。用臺盼藍染色法檢測心肌細胞濃度。用含有5-Brdu的細胞培養基將心肌細胞稀釋至2.5×106/mL和2.5×104/mL(5-Brdu的終濃度是0.1 mmol/L，其作用是抑制成纖維細胞的生長)，分別接種于6孔板和96孔板，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h后換為不含5-Brdu的正常培養液，24 h后更換細胞培養液備用。

1.3 模型構建

以43 ℃作為熱應激溫度[16]，將接種于96孔板的心肌細胞隨機分為5組，分別培養0、2、4、6、8 h，采用MTT法檢測肉雞心肌細胞相對活力，確定構建熱應激模型的時間。

1.4 試驗分組與處理

另取生長于96孔板和6孔板中的原代心肌細胞分別隨機分成3組：對照組，心肌細胞正常培養不做處理；Nrf2激活劑+HS組(TBHQ+HS組)，棄去96孔板和6孔板中的舊培養基，用PBS清洗3次，加入50 μmol/L TBHQ(以0.075%DMSO為溶劑，已驗證DMSO<0.01%時對心肌細胞活力無影響[17])在正常培養條件下預處理12 h，然后同熱應激組(HS)組同時轉移至43 ℃培養箱孵育2 h。每組6個重復。96孔板用于心肌細胞相對活力測定，6孔板用于其余指標的測定。

1.5 測定指標

1.5.1 原代心肌細胞形態學觀察 在倒置顯微鏡下觀察比較各組心肌細胞形態。

1.5.2 原代心肌細胞相對活力 應用MTT法檢測各組原代心肌細胞相對活力，于96孔板中小心吸取上清，加入90 μL新鮮培養基，再加入10 μL MTT溶液，繼續培養4 h。吸棄上清，每孔加入110 μL DMSO，低速震蕩10 min，使結晶充分溶解。用Thermo Scientific Multiskan Spectrum全波長酶標儀測490 nm處各孔的吸光值，計算公式如下：

細胞相對活力=(樣品D490 nm-本底D490 nm)/(對照D490 nm-本底D490 nm)

1.5.3 原代心肌細胞氧化應激和氧化損傷指標 用移液槍將孔中的培養液轉至1.5 mL無菌離心管中，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，吸取培養液上清轉移至另一離心管中，用于測定細胞培養液上清中LDH活性。PBS清洗3遍細胞，用細胞刮板刮取孔內心肌細胞，再加入200 μL PBS，用超聲波破碎心肌細胞，用于測定心肌細胞SOD活性和MDA含量。

1.5.4 Nrf2、HO-1、GCLC和NQO1 mRNA表達量 吸棄6孔板中的培養液，在孔內加入Trizol提取細胞總RNA，通過核酸測定儀測定RNA濃度及純度，提取的RNA反轉錄為cDNA，-20 ℃保存備用。應用Primer Premier 5.0軟件設計引物，引物信息見表1。按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR檢測。

表1 引物信息

1.5.5 Nrf2總蛋白和HO-1蛋白表達水平 棄去6孔板中的培養液,加入裂解液在冰上裂解細胞，提取蛋白，以BCA法測定蛋白濃度。細胞樣品在100 ℃水浴中加熱4 min，以充分變性蛋白。以GAPDH作為內參蛋白，Western Blotting檢測Nrf2總蛋白和HO-1蛋白表達水平：每孔上樣10 μg總蛋白，在SDS-PAGE中進行電泳分離，然后電轉至PVDF膜上；用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉2 h后，加入一抗(Nrf2/HO-1多克隆抗體，1∶500)，室溫孵育1 h后，4 ℃過夜；用TBST洗膜后，加入HRP標記的羊抗兔IgG(1∶10 000)室溫孵育1 h；TBST洗膜后，用ECL發光液檢測目標蛋白條帶的光密度，采用ImageJ圖像分析軟件對樣品中目標蛋白進行定量。

1.6 數據統計分析

用SPSS 20.0統計軟件進行數據統計分析，采用單因素方差分析考查不同熱應激時間對肉雞心肌細胞活力的影響及TBHQ對熱應激肉雞原代心肌細胞活力、抗氧化能力及Nrf2信號通路相關抗氧化基因和蛋白表達的影響，差異顯著時進行LSD多重比較。結果以平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 熱應激作用時間對肉雞原代心肌細胞相對活力的影響

由圖1可知，高溫極顯著抑制肉雞原代心肌細胞活力(P<0.01)，熱應激2 h可作為構建熱應激模型的最佳時間點。

**，與0 h相比差異極顯著(P<0.01)

2.2 TBHQ預處理對熱應激肉雞原代心肌細胞形態、細胞活力和氧化損傷的影響

2.2.1 細胞形態 由圖2可知，對照組心肌細胞呈正常梭形(圖2A)，細胞密度較大；HS組心肌細胞體積變大且出現空泡網狀結構(圖2C)，貼壁細胞數量減少；TBHQ+HS組心肌細胞空泡網狀結構明顯少于熱應激組，大部分細胞形態呈正常梭形(圖2B)。

①A，對照組；B，TBHQ+HS組；C，HS組。②a1、a2、b1，正常梭形的心肌細胞；c1、c2、b2，有空泡網狀結構的心肌細胞

2.2.2 原代心肌細胞相對活力 由圖3可知，與對照組相比，HS組心肌細胞相對活力極顯著下降(P<0.01)；與HS組相比，TBHQ+HS組心肌細胞相對活力顯著升高(P<0.05)。

與對照組相比，*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)。與HS組相比，#，差異顯著(P<0.05)；##，差異極顯著(P<0.01)。無標記，差異不顯著(P>0.05)。下同

2.2.3 原代心肌細胞SOD活性、MDA含量和細胞培養液中LDH活性 由圖4可知，與對照組相比，HS組心肌細胞SOD活性極顯著降低(P<0.01)，MDA含量極顯著升高(P<0.01)，細胞培養液中LDH活性極顯著上升(P<0.01)；與HS組比較，TBHQ+HS組心肌細胞SOD活性極顯著升高(P<0.01)，MDA含量顯著下降(P<0.05)，細胞培養液中LDH活性極顯著下降(P<0.01)。

圖4 各組肉雞原代心肌細胞SOD活性、MDA含量和細胞培養液中LDH活性

2.3 TBHQ預處理對熱應激肉雞原代心肌細胞Nrf2、HO-1、GCLC和NQO1基因表達水平的影響

由表2可知，與對照組相比，HS組肉雞原代心肌細胞中Nrf2和HO-1 mRNA表達量顯著增加(P<0.05)；與HS組比較，TBHQ+HS組肉雞原代心肌細胞中Nrf2 mRNA(P<0.05)和HO-1 mRNA的表達量極顯著增加(P<0.01)，而且Nrf2通路下游GCLC和NQO1 mRNA的表達量顯著增加(P<0.05)。

表2 各組心肌細胞Nrf2、HO-1、GCLC和NQO1 mRNA表達量

2.4 TBHQ預處理對熱應激肉雞原代心肌細胞Nrf2總蛋白和HO-1蛋白表達量的影響

由圖5可知，與對照組相比，HS組心肌細胞Nrf2總蛋白和HO-1蛋白表達量無顯著差異(P>0.05)；與HS組比較，TBHQ+HS組心肌細胞Nrf2總蛋白表達量極顯著升高(P<0.01)，HO-1蛋白表達量顯著升高(P<0.05)。

圖5 各組心肌細胞Nrf2總蛋白和HO-1蛋白表達量

3 討 論

肉雞的正常體溫為39～40 ℃，但本研究所用原代心肌細胞取自10日齡肉雞雞胚，該日齡雞胚的最適孵化溫度為37～38 ℃，而且Xu等[18]研究表明，肉雞心肌細胞40 ℃熱應激1 h即可在電鏡下觀察到自噬體，因此40 ℃不適合肉雞原代心肌細胞正常生長，因此將37 ℃作為肉雞原代心肌細胞生長的最適溫度[19]。

持續高溫可誘導肉雞心肌細胞產生氧化應激，顯著降低心臟的細胞活力[20]。為確認Nrf2通路預活化對熱應激肉雞心肌細胞活力的作用，在細胞熱應激之前加入TBHQ進行預處理。結果顯示，相比于熱應激組，TBHQ預處理可顯著提高熱應激心肌細胞的活力。心肌細胞在持續熱應激作用下會發生嚴重的腫脹、變性[21]。本研究通過對心肌細胞形態學觀察發現，熱應激不僅可導致肉雞原代心肌細胞腫脹，還會出現大量空泡網狀結構，而TBHQ預處理可顯著減少熱應激心肌細胞中空泡網狀結構。

MDA是氧自由基引發脂質過氧化反應的終產物之一,可在一定程度上反映氧自由基對機體的脂質過氧化損傷程度[22]。SOD為機體內抗氧化酶，能夠有效清除體內的氧自由基，減輕氧自由基對心肌細胞膜的損傷[23]。LDH是心肌細胞損傷的標志酶，是糖酵解途徑中重要的氧化還原酶，當心肌細胞遭受氧化損傷后，細胞膜通透性改變，LDH從細胞內釋放到細胞外，導致細胞外液中LDH活性顯著增強[24]。本研究結果顯示，與對照組相比，熱應激組心肌細胞MDA含量顯著增加，細胞外液LDH活性增加，SOD活性顯著降低，證明肉雞心肌細胞熱應激氧化損傷模型構建成功[25]。與熱應激模型組相比，TBHQ預處理能顯著提高熱應激心肌細胞SOD活性，減少MDA含量，減輕心肌細胞內LDH的外流，從而減輕熱應激對心肌細胞的氧化損傷。劉輝等[17]研究表明，通過TBHQ激活Nrf2信號通路可以頡頏氯化鈷誘發的化學性缺氧對H9c2心肌細胞的氧化應激損傷，提高心肌細胞的抗氧化應激能力。本研究與其結果基本一致，不同之處在于心肌細胞種屬不同，氧化損傷的誘因不同。

Nrf2是一種核轉錄因子，負責調控動物抗氧化酶類的轉錄表達,屬于CNC(Cap‘n’Collar)-bZIP轉錄因子家族。Keap1是一種富含半胱氨酸的蛋白質，被錨定于肌動蛋白細胞骨架。抗氧化反應元件(ARE)是一種介導HO-1、NQO1、GCLC等酶類的順式轉錄調控元件。在正常情況下，Keap1與Nrf2形成異二聚體并促進泛素-蛋白酶對Nrf2的降解作用，因此細胞內游離Nrf2含量很低。在親電試劑或應激原刺激下，Keap1蛋白的半胱氨酸殘基被修飾而構象改變，Nrf2從Keap1釋放并轉移到細胞核與ARE結合并激活靶基因HO-1、GCLC、NQO1及Nrf2自身的轉錄，啟動細胞自我保護機制[26-27]。HO-1蛋白即熱休克蛋白32[28]，是Nrf2信號通路調控的下游抗氧化酶之一，可將血紅素降解為膽綠素、一氧化碳(CO)和亞鐵，隨后膽綠素被進一步還原為膽紅素，膽綠素與膽紅素是機體內源性的強抗氧化劑，可抑制細胞脂質過氧化，清除氧自由基，直接發揮抗氧化應激的效應[29-30]。以上研究結果說明，靶向調控Nrf2蛋白及下游抗氧化酶HO-1也許能減輕熱應激誘導的心肌細胞氧化損傷。

TBHQ是一種人工合成的酚型強抗氧化劑和Nrf2激活劑，可通過自身抗氧化性和誘導Nrf2通路下游抗氧化酶的合成來減輕氧自由基對機體造成的損傷。目前認為TBHQ的抗氧化作用主要通過以下兩種途徑實現:①TBHQ本身可在體內通過醌促或非醌促氧化反應形成半醌，再轉化成醌，通過氧化還原循環來降低體內氧自由基的含量[31];②TBHQ是經典內源性抗氧化Keap1-Nrf2/ARE信號通路的特異性激活劑，其機制為TBHQ修飾Keap1的CYS 151半胱氨酸殘基，改變Keap1-Nrf2二聚體的構象，使Nrf2免受Keap1介導的泛素-蛋白酶體降解，Nrf2在細胞質中富集，多余的Nrf2在核輸入蛋白的引導下進入細胞核與ARE啟動子結合，啟動抗氧化基因和解毒酶基因及Nrf2自身的轉錄翻譯[32]。TBHQ作為公認的Nrf2激活劑，通過激活Nrf2信號通路上調通路下游抗氧化酶HO-1等基因的表達緩解亞砷酸鈉致胰島β細胞氧化應激損傷[33]，還可激活人主動脈內皮細胞Nrf2/ARE信號通路，上調通路下游NQO1的表達，進而增加SOD的活性，降低MDA含量，緩解尿毒癥患者主動脈內皮細胞功能障礙[34]，以及調控牛子宮內膜上皮細胞Nrf2和HO-1的蛋白表達，頡頏氧化應激[35]。以上研究結果均表明，TBHQ主要是通過激活Nrf2信號通路發揮抗氧化作用。這提示TBHQ對熱應激肉雞原代心肌細胞的保護作用可能也是通過激活Nrf2信號通路進而上調下游抗氧化基因的轉錄和表達而實現的。本研究的實時熒光定量PCR和Western blotting檢測結果顯示，與對照組相比，熱應激可上調Nrf2和HO-1 mRNA表達水平，但Nrf2總蛋白和HO-1蛋白表達無顯著增加，不足以頡頏熱應激誘導的氧化損傷。與熱應激組相比，用TBHQ預處理后再進行熱應激，肉雞心肌細胞GCLC、NQO1、Nrf2、HO-1 mRNA呈一致性誘導表達增多，且Nrf2總蛋白和HO-1蛋白表達顯著上調，表明TBHQ預處理可增加熱應激肉雞原代心肌細胞中Nrf2的含量和活性，使處于熱應激狀態的肉雞原代心肌細胞有足夠的Nrf2蛋白進入細胞核內與抗氧化基因的ARE啟動子結合，啟動抗氧化相關蛋白的表達，頡頏熱應激誘導的肉雞心肌細胞氧化損傷，提示Nrf2可能是調節肉雞心臟抗氧化損傷的關鍵蛋白靶點[36]。

綜上所述，Nrf2激活劑TBHQ可通過激活肉雞心肌細胞Nrf2/ARE信號通路使Nrf2蛋白表達增加，進而上調Nrf2信號通路下游抗氧化酶的轉錄活性及抗氧化HO-1蛋白表達，進一步增強肉雞心肌細胞遭受熱應激時的抗氧化能力，緩解熱應激誘導的肉雞心肌細胞氧化應激，頡頏心肌細胞氧化損傷。

本研究初步探索了活化Nrf2/ARE信號通路緩解熱應激肉雞心肌細胞氧化損傷的相關分子靶點，有利于更好地認識肉雞心臟抗氧化損傷機制，為預防熱應激致肉雞心臟損傷提供了理論依據。但應認識到Nrf2的持續激活也可能會對機體造成不良后果，且信號通路并不是單獨發揮作用，各信號通路之間會交叉串擾，例如Nrf2/ARE信號通路和NF-κB信號通路。綜合考慮各信號通路對抗氧化機制的影響是未來畜禽熱應激防控研究的方向。

4 結 論

在本試驗條件下，熱應激可激活肉雞心肌細胞抗氧化損傷機制Nrf2/ARE信號通路，但不足以頡頏熱應激誘導的氧化損傷。采用Nrf2激活劑TBHQ增加心肌細胞Nrf2總蛋白含量可以上調Nrf2/ARE信號通路下游抗氧化基因的轉錄及抗氧化蛋白的表達，顯著降低氧化損傷指標，進一步提高肉雞心肌抗氧化能力。因此，采取措施適當增加Nrf2蛋白的表達能起到保護肉雞心臟、緩解熱應激致肉雞心臟氧化損傷的作用。本試驗結果可為預防肉雞熱應激提供新的思路和有效分子靶點。