槲皮素對(duì)PEDV感染幼齡仔豬的生長(zhǎng)性能、血液生化指標(biāo)和腸道吸收與屏障功能的影響

汪曼麗，譚子涵，王帥杰，李 倩，曾一桐，王 蕾,2，趙 迪,2，張 倩，2，侯永清,2

(1.武漢輕工大學(xué)，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430023；2.武漢輕工大學(xué)，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料安全湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430023)

豬流行性腹瀉(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的一種急性腸道傳染病[1]。仔豬感染后會(huì)出現(xiàn)急性腹瀉、脫水、生長(zhǎng)性能下降等狀況[2]。目前，疫苗接種是預(yù)防PEDV的主要措施，但在近幾年中，PEDV不斷變異，在不同毒株之間經(jīng)常發(fā)生重組，甚至PEDV和其他冠狀病毒之間也會(huì)發(fā)生重組，所以疫苗接種不能有效控制PEDV感染，這使得豬場(chǎng)控制PED變得非常困難，也給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

黃酮類化合物是治療多種疾病的重要輔助劑，因其廣泛的生物活性引起了動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究者們的關(guān)注[4]。槲皮素是一種多酚類化合物。研究表明，槲皮素具有多種生物活性作用，例如抗氧化、抗病毒、抗癌和抗炎等[5]。Li等[6]通過(guò)體外試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素對(duì)PEDV表現(xiàn)出優(yōu)異的抗病毒活性；孫蕾[7]研究表明，槲皮素可有效改善脂多糖(LPS)刺激導(dǎo)致的肉雞腸道損傷。當(dāng)前，關(guān)于槲皮素對(duì)PEDV感染仔豬的影響報(bào)道較少，因此，本試驗(yàn)構(gòu)建PEDV感染幼齡仔豬模型，研究槲皮素對(duì)PEDV感染仔豬生長(zhǎng)性能、血液生化指標(biāo)和腸道吸收與屏障功能的影響，為其在防治仔豬感染PEDV中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

PEDV YN毒株(GenBank登錄號(hào)：KT021228)在Vero細(xì)胞上增殖培養(yǎng)，并保存于-80 ℃；槲皮素購(gòu)自MCE公司，純度為98.02%；試驗(yàn)飼糧為奶粉(商品名：紐瑞茲全脂奶粉)，其營(yíng)養(yǎng)成分見表1；D-木糖測(cè)定試劑盒和二胺氧化酶(DAO)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；RNAiso Plus試劑、PrimeScript?RT Reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix ExTaqTM(Tli RNaseHPlus)均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；全自動(dòng)生化分析儀(HITACHI 7020)購(gòu)自上海曼普生物科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI 7500)購(gòu)自賽默飛世爾科技公司。

表1 奶粉營(yíng)養(yǎng)成分

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與分組

本試驗(yàn)選用18頭平均體重為(2.6±0.3)kg的7日齡健康斷奶仔豬(杜洛克×長(zhǎng)白×大白)，隨機(jī)分為3個(gè)處理組：對(duì)照組、PEDV組和PEDV+槲皮素組。每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬。試驗(yàn)期11 d，第0～3天為適應(yīng)期，均飼喂人工乳(用45～55 ℃溫水沖泡奶粉，奶粉與水的比例為1∶4)。試驗(yàn)第4～10天，PEDV+槲皮素組仔豬口腔灌服10 mg/kg BW槲皮素(以人工乳配成懸濁液)，其他組仔豬口腔灌服等體積的人工乳。試驗(yàn)第8天PEDV組與PEDV+槲皮素組仔豬口腔灌服1×104.5TCID50PEDV，對(duì)照組灌服等體積的PBS溶液。

1.3 飼養(yǎng)管理

在進(jìn)行試驗(yàn)前將豬舍和豬欄徹底清洗并消毒，豬舍為密閉式，試驗(yàn)期間通風(fēng)狀況良好。豬舍分為2個(gè)，將對(duì)照組仔豬飼養(yǎng)在一間豬舍，PEDV與PEDV+槲皮素組飼養(yǎng)在另一間豬舍。兩豬舍的大小、建筑設(shè)計(jì)及室溫條件(舍溫保持在22～25 ℃)完全一致。試驗(yàn)期間每天打掃豬舍，早、晚各1次，并用聚維酮碘消毒液消毒，嚴(yán)格防止兩豬舍之間發(fā)生交叉感染。仔豬每天飼喂5次(時(shí)間為7：30、11:00、15:00、18：00、21:00)，早晚各喂1次溫水。

1.4 樣品采集與處理

于試驗(yàn)第11天早上，對(duì)仔豬進(jìn)行空腹稱重，前腔靜脈采血保存于10 mL肝素鈉抗凝管中，血樣靜置15 min后，3 500 r/min離心10 min，分離血漿，分裝，于-80 ℃保存待測(cè)。屠宰后取空腸中間段(長(zhǎng)度10 cm)，縱向剖開腸段，用預(yù)冷的無(wú)RNA酶水沖洗內(nèi)容物，刮取并收集腸黏膜，置于液氮中快速冷凍后于-80 ℃保存待測(cè)。

1.5 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.5.1 生長(zhǎng)性能 于試驗(yàn)第4、8和11天早晨給隔夜禁食的仔豬稱重，計(jì)算仔豬的平均日增重。試驗(yàn)期間采用視覺評(píng)分法每天7：00和20：30觀察仔豬的糞便形態(tài)，進(jìn)行評(píng)分，然后再計(jì)算日平均值。糞便評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：糞便正常、干燥成型記為0分；糞便呈糊狀記為1分；糞便呈半液體狀記為2分；糞便呈液體狀記為3分。

1.5.2 血液生化指標(biāo) 采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血漿中總膽紅素(TBLL)、總蛋白(TP)、血清白蛋白(ALB)、堿性磷酸酶(ALP)、血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、肌酐(CREA)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、尿素氮(BUN)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)和磷酸肌酸激酶(CK)含量。

1.5.3 血漿D-木糖含量和DAO活性 血漿D-木糖含量和DAO活性按照試劑盒說(shuō)明書的操作步驟測(cè)定。

1.5.4 空腸黏膜屏障功能相關(guān)基因mRNA水平的檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)腸道屏障功能相關(guān)基因：腸絨毛蛋白(villin)、緊密連接蛋白-1(claudin-1)、閉合蛋白(occludin)、腸型脂肪酸結(jié)合蛋白(iFABP)的相對(duì)表達(dá)量，以核糖體蛋白L4(RPL4)為內(nèi)參基因。各基因引物信息見表2。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。將空腸黏膜樣品于液氮中研磨，用RNAiso Plus試劑提取總RNA，并使用NanoDrop 2000測(cè)定RNA的濃度和純度。根據(jù)PrimeScript?RT Reagent Kit with gDNA Eraser操作步驟將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照SYBR?Premix ExTaqTM(Tli RNaseHPlus)試劑盒方法配制實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s,共40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s。參照Hou等[8]方法,以2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

表2 引物信息

續(xù)表

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 21.0進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan氏多重比較，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 槲皮素對(duì)PEDV感染仔豬平均日增重和糞便形態(tài)評(píng)分的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，PEDV感染顯著降低了仔豬的平均日增重(P<0.05)，顯著提高了仔豬糞便形態(tài)評(píng)分(P<0.05)；與PEDV組相比，灌服槲皮素顯著提高了仔豬的平均日增重(P<0.05)，且有降低糞便形態(tài)評(píng)分的趨勢(shì)(P>0.05)。

表3 各組仔豬平均日增重和糞便形態(tài)評(píng)分

2.2 槲皮素對(duì)PEDV感染仔豬血液生化指標(biāo)的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，PEDV組血液中肌酐和尿素氮的含量顯著升高(P<0.05)，高密度脂蛋白的含量顯著降低(P<0.05)；與PEDV組相比，PEDV+槲皮素組血液中肌酐和尿素氮的含量顯著降低(P<0.05)。其他指標(biāo)在3組間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表4 各組仔豬血液生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

續(xù)表

2.3 槲皮素對(duì)PEDV感染仔豬血漿DAO活力和D-木糖含量的影響

由表5可知，與對(duì)照組相比，PEDV組顯著降低了血漿中D-木糖含量(P<0.05)；與PEDV組相比，槲皮素+PEDV組顯著升高了血漿D-木糖含量(P<0.05)。DAO活性在3組間差異均不顯著(P>0.05)。

表5 各組仔豬血漿DAO活力和D-木糖含量

2.4 槲皮素對(duì)PEDV感染仔豬空腸屏障功能相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的影響

由表6可知，與對(duì)照組相比，PEDV感染下調(diào)了仔豬空腸claudin-1、iFABP基因的相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)；與PEDV組相比，灌服槲皮素顯著上調(diào)了仔豬空腸villin、claudin-1和iFABP基因的相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。

表6 各組仔豬空腸屏障功能相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

3.1 槲皮素對(duì)PEDV感染仔豬平均日增重的影響

PEDV是具有高度傳染性的急性腸道傳染病病原，PEDV感染會(huì)引起仔豬生長(zhǎng)緩慢、生產(chǎn)機(jī)能下降以及腸道功能紊亂等狀況[9]。槲皮素是植物中分布最廣的黃酮類化合物之一，并且黃酮類物質(zhì)能夠提高機(jī)體的抗病能力,促進(jìn)畜禽的生長(zhǎng)。肖風(fēng)林[10]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加適量的槲皮素，對(duì)肉雞平均日采食量和平均日增重均沒有顯著影響。王密[11]研究表明，飼喂不同水平的槲皮素對(duì)AA肉雞的生長(zhǎng)性能均無(wú)顯著影響。同樣，本研究表明在試驗(yàn)第4～8天，槲皮素對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能未產(chǎn)生顯著影響，但可緩解因PEDV感染而導(dǎo)致的生長(zhǎng)抑制。糞便形態(tài)評(píng)分是根據(jù)動(dòng)物糞便成型狀態(tài)進(jìn)行判斷，可反應(yīng)動(dòng)物的腹瀉情況。Xu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中補(bǔ)充槲皮素可降低斷奶仔豬糞便評(píng)分。在本研究中，PEDV感染后，仔豬的糞便形態(tài)評(píng)分顯著提高，添加槲皮素后糞便形態(tài)評(píng)分有降低的趨勢(shì)，說(shuō)明槲皮素對(duì)仔豬腹瀉有一定的緩解作用，這可能與槲皮素具有抗病毒和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用有關(guān)[6，13]。

3.2 槲皮素對(duì)PEDV感染仔豬血液生化指標(biāo)的影響

高密度脂蛋白是由數(shù)百種不同脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成的脂蛋白顆粒的異質(zhì)混合物，有1/3的已鑒定蛋白質(zhì)在脂質(zhì)代謝中起作用，其余蛋白質(zhì)在蛋白酶抑制、補(bǔ)體調(diào)節(jié)、止血和炎癥中發(fā)揮作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，PEDV感染后血液中高密度脂蛋白含量降低，說(shuō)明PEDV感染導(dǎo)致仔豬產(chǎn)生應(yīng)激。血液生化指標(biāo)的差異與機(jī)體新陳代謝、營(yíng)養(yǎng)狀況的改變和疾病的發(fā)生密切相關(guān)，而血液尿素氮和肌酐是反應(yīng)腎功能的重要標(biāo)志物[15]，同時(shí)在一定程度上可間接反映動(dòng)物機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)的利用效率。Chen等[16]研究發(fā)現(xiàn)，血清尿素氮含量上升可減少蛋白質(zhì)合成沉積，降低氮的利用率，表明其含量高低與蛋白質(zhì)利用效率和生長(zhǎng)性能呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)機(jī)體腎功能損傷時(shí)，血液尿素氮和肌酐的水平會(huì)相應(yīng)增加[17]。卓秀萍等[18]研究發(fā)現(xiàn)，PEDV感染會(huì)導(dǎo)致哺乳仔豬腎表面出現(xiàn)細(xì)小出血點(diǎn)以及蛋白管型，表明PEDV感染會(huì)導(dǎo)致仔豬腎臟損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可顯著降低斷奶仔豬血清尿素氮的含量[19]，在LPS誘導(dǎo)的小鼠腎損傷模型中，槲皮素可降低血液肌酐和尿素氮的水平[20]。另有研究表明，通過(guò)血液進(jìn)入腎臟的槲皮素代謝物因腎臟代謝而發(fā)生轉(zhuǎn)化反應(yīng)，可對(duì)腎臟起保護(hù)作用[21]。本試驗(yàn)中，槲皮素可緩解PEDV感染導(dǎo)致的仔豬血液尿素氮和肌酐含量的增加，這一結(jié)果表明仔豬在攝取槲皮素后可通過(guò)提高機(jī)體氨基酸利用率和改善蛋白質(zhì)代謝，緩解因PEDV感染導(dǎo)致的腎功能損傷。

3.3 槲皮素對(duì)PEDV感染仔豬血漿DAO活性和D-木糖含量的影響

DAO是小腸黏膜上層絨毛中具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶，其活性可以作為腸黏膜完整性以及黏膜損傷和恢復(fù)的重要標(biāo)志物，腸道黏膜細(xì)胞受損壞死后，DAO會(huì)釋放至血液中，導(dǎo)致血漿中DAO活性增加[22]。本試驗(yàn)中，PEDV感染未顯著提高血漿DAO活性，這可能與PEDV的毒力有關(guān)。血漿D-木糖濃度是腸道吸收能力的特異性和敏感指標(biāo)。在健康豬中，D-木糖很容易被小腸吸收。然而，在吸收不良、腸道發(fā)生損傷時(shí)，D-木糖從腸腔到門靜脈的通路受損，經(jīng)腸道吸收后不會(huì)被機(jī)體代謝，并最終被腎臟排出，從而降低了血液和尿素中的D-木糖濃度[22]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，槲皮素可以緩解PEDV感染導(dǎo)致的血漿D-木糖含量降低。目前關(guān)于槲皮素治療PEDV感染仔豬的報(bào)道較少，但有研究表明，飼糧中添加槲皮素可增加空腸絨毛高度[23]，而腸絨毛高度的增加有助于改善小腸的吸收功能[24]，因此推測(cè)槲皮素可能通過(guò)改善腸道結(jié)構(gòu)來(lái)增強(qiáng)小腸吸收營(yíng)養(yǎng)的能力。

3.4 槲皮素對(duì)PEDV感染仔豬空腸屏障功能相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的影響

腸道屏障在維持腸道和整個(gè)身體的免疫穩(wěn)態(tài)方面起著極其重要的作用。緊密連接(TJ)是腸道屏障的重要組成部分，與腸道損傷和炎癥密切相關(guān)。occludin和claudin-1是緊密連接的組成成分，對(duì)于維持腸道通透性和腸道屏障功能至關(guān)重要[25]。Luo等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)情況下，病原體感染宿主細(xì)胞可減少細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)，如claudin-1和occludin。Suzuki等[27]發(fā)現(xiàn)，槲皮素可促進(jìn)Caco-2細(xì)胞TJ蛋白、occludin和claudin-1的組裝來(lái)增強(qiáng)腸道屏障功能。本試驗(yàn)結(jié)果表明，PEDV感染下調(diào)了仔豬空腸claudin-1基因的相對(duì)表達(dá)量，添加槲皮素后，上調(diào)了仔豬空腸claudin-1和occludin基因的相對(duì)表達(dá)量，這與上述結(jié)果基本一致，說(shuō)明槲皮素可改善仔豬腸道物理屏障，促進(jìn)機(jī)體健康。

villin是一種組織特異性肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，在腸細(xì)胞和近端腎細(xì)胞的刷狀緣中表達(dá)[28]。在小腸上皮細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中，villin可決定腸細(xì)胞分化程度，并維持其分化狀態(tài)。iFABP是一種細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白，在長(zhǎng)鏈脂肪酸的運(yùn)輸中發(fā)揮作用，被認(rèn)為是腸損傷和腸道屏障功能衰竭的可靠生物標(biāo)志物[29]。本研究中，PEDV感染顯著下調(diào)了iFABP基因的相對(duì)表達(dá)量，這與李鵬等[9]研究結(jié)果一致。有研究指出槲皮素的吸收主要發(fā)生在小腸[30],本試驗(yàn)中，添加槲皮素后，感染仔豬空腸villin和iFABP基因的相對(duì)表達(dá)量升高，表明槲皮素可減輕腸道損傷，改善腸道功能，這可能是由于腸道吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后促進(jìn)了腸黏膜上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，進(jìn)而緩解PEDV對(duì)腸黏膜的損傷。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，仔豬飼糧中添加10 mg/kg BW的槲皮素可緩解因PEDV感染導(dǎo)致的平均日增重下降和腎功能損傷，可以增強(qiáng)機(jī)體腸道的吸收和屏障功能。