波爾山羊PLAG1基因克隆、多態性鑒定及其與出生體重、體尺性狀的關聯分析

馮小品，李隱俠，張晨儉，張 俊，孟春花，錢 勇，曹少先

(1.江蘇省農業科學院畜牧研究所，南京 210014；2.江蘇省農業種質資源保護與利用平臺，南京 210014;3.農業農村部種養結合重點實驗室，南京 210014)

多型性腺瘤基因1 (pleomorphic adenoma gene 1，PLAG1)屬于多形性腺瘤基因家族成員之一，是一種鋅指轉錄因子，早期研究認為僅可促進多形性腺瘤的發生[1]，后來陸續發現PLAG1能促進脂肪母細胞瘤、肝母細胞瘤等多種腫瘤的發生，其機制是PLAG1發生強啟動子替換后表達上調，通過與胰島素樣生長因子2(insulin-like growth factor 2，IGF2)啟動子結合上調IGF2表達，促進腫瘤細胞的增殖與抗凋亡[2-3]。研究發現，PLAG1基因敲除小鼠胎兒生長發育受到抑制[4]；PLAG1基因外顯子的移碼突變導致編碼蛋白變短后引起人胎兒出生重和身高下降[5]，提示PLAG1參與調控胎兒生長發育。此外，PLAG1基因突變還與家畜的體重、體尺和屠宰性狀相關聯，湖羊PLAG1基因啟動子區存在4個緊密連鎖位點，且與出生體重和斷奶體重均顯著相關[6]；牛PLAG1基因鄰近區域的1個數量性狀核苷酸序列(quantitative trait nucleotides,QTN)與腿肌重、日增重、體長和胴體性狀相關聯[7-8]，且其SNPs位點影響牛早期體重、6～8月齡體重等生長性狀[9]。目前，波爾山羊的PLAG1基因序列尚未被克隆，其多態性與其早期生長發育性狀的關聯分析鮮見報道。本試驗以波爾山羊為對象，克隆PLAG1基因序列，鑒定其在不同年齡和出生體重波爾山羊組織中的表達模式，篩選波爾山羊PLAG1基因SNP位點，并與出生羔羊的生長指標(出生體重、出生體長、出生體高、出生胸圍和出生管圍)進行關聯分析，以期為山羊的早期分子育種提供候選分子標記。

1 材料與方法

1.1 材料

217只波爾山羊羔羊及其生長性狀(出生體重、出生體長、出生胸圍和出生管圍等按照常規方法測定)相關資料均由江蘇省農業科學院六合動物實驗基地提供。試驗羊在相同飼養環境和營養水平下統一管理。采集試驗羊耳組織置于凍存管中，用冰桶帶回實驗室，―20 ℃保存備用。隨機挑選6只初生羔羊，按照體重大小分為2組：一組出生體重分別為2.6、2.5和2.4 kg，平均出生體重為2.5 kg，為出生體重較高組；另一組出生體重分別為2.3、2.1和1.9 kg，平均出生體重為2.1 kg，為出生體重較低組，兩組羊出生體重差異顯著(P<0.05)。選取1歲母羊和120日齡胎羊各3只，屠宰后取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、睪丸、腿肌、小腸等組織于凍存管后立即放于液氮中，帶回實驗室―80 ℃保存備用。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)；逆轉錄試劑盒、2×TaqMasterMix、Real-time PCR試劑盒、瓊脂糖(南京諾唯贊生物科技有限公司)；BCA試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；蛋白抗體PLAG1(#H0000532，Abnova公司)；β-tubulin(#11224-1-AP，Proteintech公司)。

1.3 DNA、RNA提取和反轉錄

采用酚/氯仿法提取波爾山羊耳組織DNA，采用RNA提取試劑盒提取組織總RNA，使用分光光度計測定RNA濃度與純度，使用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，―20 ℃保存備用。

1.4 引物設計與合成

根據NCBI數據庫中山羊PLAG1基因預測序列(GenBank登錄號：XM_005688991.3)，利用Primer Primier 5.0軟件設計特異性引物，用于波爾山羊PLAG1基因CDS、3′-UTR區序列擴增及SNP篩選，并設計PLAG1基因定量引物，以β-actin(GenBank登錄號：NM_001314342)為內參基因，鑒定波爾山羊各組織中PLAG1基因表達量，引物信息見表1。引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 引物信息

1.5 PCR擴增及克隆測序

以波爾山羊腿肌cDNA為模板，利用P1、P2 2對引物通過巢式PCR對PLAG1基因CDS區進行擴增，利用引物P5對PLAG1基因3′-UTR區序列進行擴增。PCR擴增體系20 μL：2×TaqMasterMix (Dye Plus) 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，滅菌水補足體系。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58/60 ℃退火30 s，72 ℃延伸100 s，共35個循環；72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將純化回收的DNA與pMD19-T克隆載體于16 ℃連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂于含Amp抗性的LB平板，37 ℃培養過夜，挑取單克隆菌落培養，陽性菌液經PCR鑒定(用引物P2進行菌液PCR鑒定)后送南京擎科生物有限公司測序。

1.6 序列分析

用DNAMAN 6.0和DNAStar軟件進行氨基酸序列翻譯及與其他物種序列比對，同源序列用NCBI BLAST進行搜索，使用NCBI的ORF Finder(http:∥www.ncbi.nih.gov/projects/gorf)進行開放閱讀框預測。

1.7 實時熒光定量PCR和Western blotting

以β-actin為內參，采用實時熒光定量PCR方法檢測不同出生體重波爾山羊羔羊、胎羊和成年母羊心臟、肝臟、脾臟、睪丸、小腸和骨骼肌組織中PLAG1基因的表達水平。PCR反應體系20 μL：cDNA 2.0 μL，2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddH2O 7.2 μL。PCR反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。定量結果采用2―△△Ct法進行處理分析。

分別提取不同體重羔羊腿肌總蛋白，BCA方法測定蛋白濃度。參照李隱俠等[10]方法進行Western blotting試驗，使用Image J軟件進行條帶密度分析。

1.8 PLAG1基因在波爾山羊群體中SNPs鑒定及基因分型

隨機挑選30個波爾山羊耳組織DNA樣，每5個DNA樣混為1個DNA池。以混池DNA為模板，利用P1、P2和P5引物進行PLAG1基因CDS和3′-UTR區序列擴增，PCR擴增程序同1.5，PCR擴增產物送南京擎科生物科技有限公司測序。測序結果經Chromas 2.3軟件分析，查找SNPs位點，再對217只波爾山羊進行PCR擴增、測序和基因分型，統計不同基因型在波爾山羊群體中的基因頻率、基因型頻率、多態信息含量(polymorphism information content,PIC)、雜合度(heterozygosity,He)等指標。

1.9 數據分析

利用SPSS 19.0軟件中單因素方差分析(One-Way ANOVA)對PLAG1基因各SNP位點不同基因型與波爾山羊出生體重、出生體長、出生胸圍和出生管圍進行關聯分析，數據以平均值±標準差表示。P<0.05為差異顯著；P<0.01為差異極顯著。

2 結 果

2.1 PLAG1基因CDS和3′-UTR區序列擴增

以波爾山羊腿肌cDNA為模板，以P1和P2為引物，采用巢式PCR方法擴增波爾山羊PLAG1基因CDS區，經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，巢式PCR擴增產物呈現單一DNA條帶，片段大小約為1 596 bp(圖1A)，與預期片段大小一致。對鑒定正確的產物切膠回收后克隆測序，對所獲序列進行比對，獲得山羊PLAG1基因CDS區全長序列；以P5為引物擴增波爾山羊PLAG1基因3′-UTR序列，獲得長約1 689 bp的片段(圖1B)，與預期大小一致。兩段序列與GenBank數據庫中山羊PLAG1基因預測序列(登錄號：XM_013969222)的相似性均為100%。

2.2 波爾山羊PLAG1序列分析

序列分析發現，波爾山羊PLAG1基因CDS區全長1 500 bp，A、T、G、C含量分別為24.07%、18.60%、25.33%和32.00%，其中GC含量為57.33%，AT含量為42.67%，共編碼499個氨基酸。DNAMAN軟件比對發現，波爾山羊PLAG1基因CDS區序列與人(登錄號：NM_001114634)、豬(登錄號：XM_021089354)、牛(登錄號：XM_005215432)、綿羊(登錄號：XM_012183720.2)等哺乳動物的核苷酸序列相似性分別為85.6%、91.6%、98.6%和99.2%，氨基酸序列相似性分別為96.4%、95.2%、99.8%和99.8%(表2)。山羊與綿羊、牛的氨基酸序列相似性最高，均在第366位氨基酸處有差別，綿羊和牛為纈氨酸，而山羊為蛋氨酸，說明在哺乳動物中PLAG1蛋白非常保守。

表2 波爾山羊與其他哺乳動物間PLAG1基因核苷酸和氨基酸序列相似性

2.3 山羊PLAG1基因的組織表達模式

實時熒光定量PCR檢測發現，PLAG1基因在出生體重較大的羔羊心臟、肝臟、脾臟、睪丸、小腸和腿肌中的表達水平高于出生體重較小的羔羊組織，其中心臟和腿肌中表達量差異顯著(P<0.05)，小腸中表達量差異極顯著(P<0.01)(圖2)。出生體重較大的羔羊腿肌中PLAG1蛋白表達水平極顯著高于羔羊體重較小羔羊(P<0.01，圖3)。PLAG1基因在成年母羊各組織中的表達水平普遍偏低，均顯著或極顯著低于妊娠末期胎羊各組織(P<0.05；P<0.01，圖4)。

*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)。下同

圖3 PLAG1蛋白在不同出生體重羔羊腿肌中的表達量

圖4 PLAG1基因在胎羊和成年母羊各組織中的表達量

2.4 波爾山羊PLAG1基因SNP位點篩選

利用P1、P2和P5引物擴增波爾山羊群體PLAG1基因序列，PCR擴增產物測序后經Chromas 2.3軟件分析，在PLAG1基因3′-UTR區序列中共檢測到6個SNPs位點，按照SNPs位點與GenBank數據庫中預測的山羊PLAG1基因mRNA序列(登錄號：XM_013969222.2)起始密碼子的距離分別命名為：2664 A>G、2712 A>G、2721 T>C、2879 T>A、2990 A>T和3270 A>G(圖5)。

圖5 波爾山羊PLAG1基因SNPs位點測序圖

2.5 PLAG1基因SNPs位點基因頻率和基因型頻率

由表3可知，在217只波爾山羊樣本中，6個SNPs位點均被檢測到3種基因型，其中，2664 A>G、2712 A>G、2990 A>T、3270 A>G位點的優勢等位基因均為A，基因頻率分別為68.9%、74.2%、91.5%和77.7%；2721 T>C和2879 T>A位點優勢等位基因均為T，基因頻率分別為71.4%和68.7%；除2990 A>T位點多態信息含量為低度多態外(PIC<0.25)，其余5個位點均為中度多態(0.25G位點偏離哈迪-溫伯格平衡狀態外(P<0.05)，其余5個位點均處于哈迪-溫伯格平衡狀態(P>0.05)。

表3 波爾山羊PLAG1基因SNPs位點基因型頻率、基因頻率及遺傳多樣性

2.6 PLAG1基因SNPs位點不同基因型與波爾山羊出生體重、體尺的關聯分析

由表4可知，在217只波爾山羊樣本中，2664 A>G位點AG基因型個體出生管圍顯著大于GG型(P<0.05)；2721 T>C位點TT基因型個體出生體長顯著大于TC基因型(P<0.05)，TT基因型個體出生體重有大于TC基因型個體的趨勢，提示T等位基因對體長和體重的增加更有利；2879 T>A位點TA基因型個體出生管圍顯著大于AA基因型(P<0.05)；2990 A>T位點AA基因型個體出生體重顯著大于AT基因型(P<0.05)，AA基因型個體在體尺性狀上雖然與AT、TT基因型差異不顯著，但有上升趨勢；3270 A>G位點GG基因型個體出生體長顯著大于AA基因型(P<0.05)，AG基因型個體出生胸圍顯著大于AA基因型(P<0.05)，GG基因型個體在體重、體高、管圍3個性狀上均有上升趨勢，提示G等位基因對波爾山羊生長有利；其余位點各指標差異均不顯著(P>0.05)。

表4 PLAG1基因SNPs位點各基因型與波爾山羊出生體重、體尺的關聯分析

3 討 論

3.1 PLAG1序列及組織表達特征

研究表明，序列高度一致的蛋白質其結構和功能高度相似[11]。Sousounis等[12]研究發現，在分子進化過程中，蛋白質的結構越保守其功能也越保守。本研究獲得波爾山羊PLAG1基因CDS區全長1 500 bp，編碼499個氨基酸。序列比對發現，PLAG1蛋白在哺乳動物間相似性達到95.2%以上，與牛和綿羊的相似性均為99.8%，說明PLAG1蛋白在哺乳動物進化過程中非常保守。研究發現，敲除PLAG1基因可導致小鼠胎兒生長發育受阻[4]，PLAG1基因突變影響牛、豬和綿羊的生長和屠宰性狀[7，13-14]，提示PLAG1基因可能在波爾山羊生長發育中發揮十分重要的功能。PLAG1基因在胚胎期的表達量較高，而在大多數成體器官中的表達量較低或不表達[5]。PLAG1基因主要在人胚胎組織中表達，而在成人組織如心臟、腦、肺臟、肝臟、骨骼肌和胰腺中的表達量較低[1]。成年小鼠PLAG1基因轉錄本在腦、胸腺、胃、腸、脾臟、前列腺、骨骼肌、腎臟、唾液腺、子宮、舌、肺臟和肝臟中的表達量均低于檢測限[1]。本試驗結果顯示，不同出生體重羔羊PLAG1基因在心臟、小腸和腿肌組織中呈差異表達，提示PLAG1基因可能通過調控肌肉發育影響羔羊體重，而胎羊心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸和腿肌組織中的表達量均顯著或極顯著高于成年母羊，說明山羊組織中PLAG1基因的表達模式與小鼠和人相似，在胎兒期表達量較高，出生后隨著年齡增加表達量逐漸降低。

3.2 PLAG1基因與動物生長的關系

Hensen等[4]研究發現，PLAG1基因缺失小鼠體型較小：從胚胎期11.5 d開始，PLAG1基因缺失小鼠胚胎比同窩對照組胚胎小約18%；出生時，PLAG1基因缺失小鼠幼仔僅占同窩野生型小鼠體重的70%；出生后21 d，PLAG1基因缺失小鼠體重比同窩對照組小約50%，說明PLAG1基因敲除使小鼠胚胎期和出生后生長受阻。本試驗發現，PLAG1基因表達水平與波爾山羊出生體重呈顯著關聯，出生體重較大的羔羊心臟、肝臟、脾臟、睪丸、小腸、腿肌組織中PLAG1基因表達量均大于出生體重較小的羔羊，其中心臟和腿肌中表達量差異顯著，小腸中表達量差異極顯著；出生體重較大的羔羊腿肌中PLAG1基因表達量極顯著高于出生體重較小的羔羊，這與Hensen等[4]研究結果相似，提示PLAG1基因表達與羔羊體重相關，為進一步研究PLAG1基因對山羊生長性狀的影響提供了依據。

大量研究表明，PLAG1基因在動物的生長調控中起關鍵作用，在豬、牛、馬、綿羊中均已發現與體尺、體重性狀相關的SNPs[6,8,15-17]；PLAG1基因是影響豬平均背脂厚、肢骨長的候選基因[18-19]，與豬的脊椎數呈顯著相關，從而影響豬的體長性狀[20]。Utsunomiya等[13]研究發現，現代牛體長的恢復主要受到PLAG1基因單倍型(Q)選擇的影響。本研究發現，2721 T>C位點TT基因型個體出生體長顯著大于TC基因型，3270 A>G位點GG基因型個體出生體長顯著大于AA基因型，提示2721 T>C位點TT基因型和3270 A>G位點GG基因型可以用于波爾山羊選育，其影響體長的原因有待進一步研究。研究發現，PLAG1-NCAPG基因間隔區1個QTN與日本和牛閹牛日增重、體長、胴體性狀相關[8]；PLAG1基因SNPs可影響牛早期體重及6～8月齡體重[9]；PLAG1基因中1個15 bp插入顯著上調了山羊的體重和胸圍[21]。本研究發現，2990 A>T位點AA基因型個體出生體重顯著高于AT基因型，AA基因型個體體尺相關性狀均有增加的趨勢，提示2990 A>T位點AA基因型有利于增加波爾山羊體重。綜上所述，PLAG1基因分子標記可用于山羊體尺和體重的選育。

4 結 論

本研究克隆獲得波爾山羊PLAG1基因CDS區全長1 500 bp序列。PLAG1基因在胎羊各組織中表達水平極顯著高于成年羊，PLAG1基因表達量高、低與羔羊出生體重呈顯著關聯。在波爾山羊群體中共篩選到6個PLAG1基因SNPs位點，其中2721 T>C位點TT基因型、2990 A>T位點AA基因型、3270 A>G位點GG基因型均為有利基因型，可顯著增加波爾山羊的出生體重及體尺，表明PLAG1基因可作為候選基因用于波爾山羊早期生長選擇。