不同濃度牛磺酸對(duì)豬精液負(fù)壓條件常溫保存效果的影響

王赫川，張 涵，李天峰，王 騫，張 群，郭銘暉，孫 超，周彥芝，李 遠(yuǎn)，李雁冰，魏國生，李井春

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319)

豬精子質(zhì)膜的低膽固醇/磷脂導(dǎo)致其對(duì)冷休克高度敏感，因而在生產(chǎn)實(shí)踐中一般在15～18 ℃下保存豬精液，以盡可能維持其各項(xiàng)生理性能的穩(wěn)定。雖然精子的獲能反應(yīng)及頂體反應(yīng)等關(guān)鍵生理過程需要適當(dāng)濃度的活性氧(ROS)，但精子在保存過程中仍不可避免地要遭受細(xì)胞外環(huán)境脅迫導(dǎo)致的過量ROS，ROS對(duì)精子頂體完整性、質(zhì)膜完整性及線粒體活性等均會(huì)產(chǎn)生不可逆影響。因此在精液稀釋劑中添加抗氧化物質(zhì)是目前家畜精液保存的常見手段之一。

牛磺酸(β-氨基乙磺酸)是半胱氨酸的重要衍生物，于1827年從牛膽汁中分離并命名為Gallen-Asparagin，1838年正式改名為牛磺酸[1]。牛磺酸具有神經(jīng)保護(hù)、抗炎、免疫調(diào)節(jié)及抗氧化等生理作用[2-5]。牛磺酸的抗氧化能力主要通過以下4個(gè)方面體現(xiàn)：參與自由基清除；維持線粒體電子傳遞鏈在應(yīng)激狀態(tài)下的完整性；穩(wěn)定生物膜系統(tǒng)；抑制機(jī)體特定的ROS產(chǎn)生酶類[6]。Vasco等[7]研究表明，精液在常溫保存時(shí)直接與空氣中的高濃度氧接觸，相較于冷凍保存不可避免地產(chǎn)生更多ROS，并持續(xù)對(duì)精子產(chǎn)生毒害作用。同時(shí)當(dāng)環(huán)境中ROS堆積量超過其清除速度時(shí)會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致精子的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)(LPO)，表現(xiàn)為質(zhì)膜脂肪酸流失、質(zhì)膜流動(dòng)性及完整性降低等[8]。

常溫保存環(huán)境中氧的存在也會(huì)加劇精子的氧化應(yīng)激進(jìn)而造成死亡，而負(fù)壓環(huán)境能夠有效降低環(huán)境氧濃度以減弱精子的活動(dòng)強(qiáng)度，盡可能地降低精子能量消耗及氧化應(yīng)激情況[9]。李琦等[10]在常壓及不同負(fù)壓條件下使用Modena稀釋劑17 ℃保存豬精液，結(jié)果表明―0.04 Mpa環(huán)境下的豬精子代謝水平與氧化應(yīng)激顯著降低，能夠較好地提升豬精液的保存質(zhì)量。本研究擬在―0.04 Mpa條件下向Modena稀釋劑中添加不同濃度牛磺酸，并在17 ℃下保存豬精液11 d，檢測(cè)精子活力、活率、畸形率、動(dòng)力學(xué)參數(shù)、總抗氧化能力(T-AOC)及H2O2含量，分析負(fù)壓條件下牛磺酸對(duì)豬精液常溫保存質(zhì)量與抗氧化能力的影響，以期為豬精液保存技術(shù)的發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2～3歲健康長白豬4頭，選自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)實(shí)驗(yàn)豬場(chǎng)。采用手握法采集精液，并確保采精頻率一致(每周2次)。光學(xué)顯微鏡檢查精液，選取呈淺灰白或乳白色且精子估測(cè)活力≥0.7、微腥無異味的精液作為試驗(yàn)材料。檢測(cè)完畢后，將4頭公豬的合格精液混合并在1 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室，期間注意避免劇烈晃動(dòng)以減少對(duì)精子的機(jī)械性損傷。

1.2 主要試劑及儀器

牛磺酸(江蘇佰耀生物科技有限公司)；檸檬酸鈉及NaHCO3(天津博迪化工有限公司)；葡萄糖及鏈霉素(北京博奧拓達(dá)科技有限公司)；檸檬酸及Tris(西隴科學(xué)股份有限公司)；EDTA-2Na、牛血清白蛋白(BSA,Sigma公司)；青霉素(浙江金華康恩貝生物制藥有限公司)；H2O2及T-AOC檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)(CASA,南寧松景天倫生物科技有限公司)；XDS-1B型倒置生物顯微鏡(上海精密儀器儀表有限公司)；DH5000BII型恒溫培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；TDL-60型低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；85-1型恒溫磁力攪拌儀(金壇榮華儀器制造有限公司)；XW-80A型漩渦混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；CP114型電子分析天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)。

1.3 稀釋劑配制

準(zhǔn)確稱量葡萄糖6.875 g、檸檬酸鈉1.725 g、Tris 1.413 g、BSA 1.000 g、檸檬酸0.725 g、EDTA-2Na 0.650 g、NaHCO30.250 g、青霉素0.0185 g、鏈霉素0.0125 g，加入雙蒸水混合溶解并定容至250 mL配成Modena精液稀釋劑，用0.22 μm濾器過濾后置4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 精液分組及處理

在Modena稀釋劑中分別添加不同濃度牛磺酸，使最終濃度分別為1、5、10 mmol/L，置于4 ℃?zhèn)溆谩⒕浩骄譃?份，1 800 r/min離心5 min，棄上清后使用血球計(jì)數(shù)板檢測(cè)精子密度，用0(對(duì)照組)、1、5、10 mmol/L牛磺酸的Modena稀釋劑將精子密度調(diào)整至1×108/mL。將稀釋后的各組精液分裝入試管并半旋緊置于負(fù)壓瓶中，使用真空泵調(diào)整瓶內(nèi)氣壓至―0.04 Mpa，負(fù)壓瓶置于17 ℃恒溫箱中保存11 d。每12 h對(duì)所有試管進(jìn)行緩慢混勻1次。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定 分別在精液保存的第0、1、3、5、7、9、11天檢測(cè)每組精液中精子的活力、活率、畸形率、曲線速度(VCL)、平均路徑速度(VAP)及鞭打頻率(BCF)。活力指前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子占總體的百分率；活率指具有運(yùn)動(dòng)能力精子占總體的百分率；畸形率指尾段缺失、頭部缺損、過度彎曲精子占總體的百分率；VCL指精子前進(jìn)曲線瞬時(shí)速度的平均值；VAP指精子平均運(yùn)動(dòng)軌跡的速度；BCF指精子尾部每秒的鞭打次數(shù)。

提前將CASA的加熱載物臺(tái)預(yù)熱至37 ℃。每組取20 μL精液，加入17 ℃預(yù)處理的Modena稀釋劑40 μL進(jìn)行稀釋。稀釋完成后置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中復(fù)蘇10 min，之后取10 μL精液滴加于載玻片上，緩慢蓋上蓋玻片使其形成均勻液膜，調(diào)節(jié)CASA至視野清晰。每組隨機(jī)選擇5個(gè)觀測(cè)視野，每個(gè)視野中精子計(jì)數(shù)不少于100個(gè)。

1.5.2 抗氧化能力測(cè)定 按試劑盒說明書測(cè)定精液T-AOC及H2O2含量，每組均設(shè)置4次重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

用Stat View 5.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，用Duncan氏法進(jìn)行組間多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度牛磺酸對(duì)精子活力及活率的影響

2.1.1 不同濃度牛磺酸對(duì)精子活力的影響 由表1可知，在1～11 d中，3個(gè)牛磺酸組與對(duì)照組精子活力均存在顯著差異(P<0.05)，其中5 mmol/L牛磺酸組總體保存效果最佳。第1、3、5天時(shí)，3個(gè)牛磺酸組間精子活力差異不顯著(P>0.05)；第7、9、11天時(shí)，5 mmol/L牛磺酸組精子活力均顯著高于1與10 mmol/L牛磺酸組(P<0.05)，但1與10 mmol/L牛磺酸組間精子活力差異不顯著(P>0.05)。

表1 不同濃度牛磺酸組豬精子活力

2.1.2 不同濃度牛磺酸對(duì)精子活率的影響 由表2可知，在1～11 d中，3個(gè)牛磺酸組與對(duì)照組間精子活率均差異顯著(P<0.05)，其中5 mmol/L牛磺酸組總體保存效果最佳。在第1、3天時(shí)，3個(gè)牛磺酸組間精子活率差異不顯著(P>0.05)；第5天時(shí)，5與10 mmol/L牛磺酸組精子活率顯著高于1 mmol/L牛磺酸組(P<0.05)；第7、9、11天時(shí)，5 mmol/L牛磺酸組精子活率顯著高于1與10 mmol/L牛磺酸組(P<0.05)，而1與10 mmol/L牛磺酸組間精子活率差異不顯著(P>0.05)。

表2 不同濃度牛磺酸組豬精子活率

2.2 不同濃度牛磺酸對(duì)精子畸形率的影響

由表3可知，第1天時(shí)，5與10 mmol/L牛磺酸組精子畸形率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，1 mmol/L牛磺酸組與對(duì)照組相比則差異不顯著(P>0.05)；第3天時(shí)，5 mmol/L牛磺酸組精子畸形率顯著低于1 mmol/L牛磺酸組(P<0.05)；第5天時(shí)，所有處理組(0、1、5、10 mmol/L)間精子畸形率均無顯著差異(P>0.05)；第7天時(shí)，3個(gè)牛磺酸組間精子畸形率無顯著差異(P>0.05)，但均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；第9天時(shí)，5 mmol/L牛磺酸組分別與1及10 mmol/L牛磺酸組間精子畸形率無顯著差異(P>0.05)；第11天時(shí)，5 mmol/L牛磺酸組精子畸形率顯著低于1及10 mmol/L牛磺酸組(P<0.05)。

表3 不同濃度牛磺酸組豬精子畸形率

2.3 不同濃度牛磺酸對(duì)精子動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

2.3.1 不同濃度牛磺酸對(duì)精子VAP的影響 由表4可知，第1天時(shí)，所有處理組間精子的VAP差異均不顯著(P>0.05)；第3、5、7、9、11天時(shí)，各牛磺酸添加組精子的VAP均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；第7、9、11天時(shí)，5 mmol/L牛磺酸組精子的VAP顯著高于10 mmol/L牛磺酸組(P<0.05)。

表4 不同濃度牛磺酸組豬精子VAP

2.3.2 不同濃度牛磺酸對(duì)精子VCL的影響 由表5可知，第1、3、5、7天時(shí)，5與10 mmol/L牛磺酸組精子的VCL顯著高于1 mmol/L牛磺酸組與對(duì)照組(P<0.05)；第9、11天時(shí)，5 mmol/L牛磺酸組精子的VCL顯著高于其他各組(P<0.05)，1與10 mmol/L牛磺酸組間精子的VCL差異不顯著(P>0.05)，但均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表5 不同濃度牛磺酸組豬精子VCL

2.3.3 不同濃度牛磺酸對(duì)精子BCF的影響 由表6可知，第1、3、5天時(shí)，所有處理組間精子的BCF差異均不顯著(P>0.05)；第7、9、11天時(shí)，5 mmol/L牛磺酸組精子的BCF顯著高于其他各組(P<0.05),1與10 mmol/L牛磺酸組間精子的BCF差異不顯著(P>0.05)，但均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表6 不同濃度牛磺酸組豬精子BCF

2.4 不同濃度牛磺酸對(duì)精子抗氧化能力的影響

2.4.1 不同濃度牛磺酸對(duì)精子T-AOC的影響 由表7可知，第1、3、5、7、9天時(shí)，3個(gè)牛磺酸組精子T-AOC均顯著高于對(duì)照組(P<0.05),其中5 mmol/L牛磺酸組精子T-AOC顯著高于其他各組(P<0.05)；第1、7、9天時(shí)，1與10 mmol/L牛磺酸組精子T-AOC差異不顯著(P>0.05)；第3、5天時(shí)，10 mmol/L牛磺酸組精子T-AOC顯著高于1 mmol/L牛磺酸組(P<0.05)。

表7 不同濃度牛磺酸組豬精子T-AOC

2.4.2 不同濃度牛磺酸對(duì)精子H2O2含量的影響 由表8可知，第1、3天時(shí)，所有處理組間精子H2O2含量均無顯著差異(P>0.05)；第5、7、9、11天時(shí)，3個(gè)牛磺酸組間精子H2O2含量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；第9天時(shí)，5 mmol/L牛磺酸組精子H2O2含量顯著低于1與10 mmol/L牛磺酸組(P<0.05)；第11天時(shí)，5 mmol/L牛磺酸組豬精子中H2O2含量最低。

表8 不同濃度牛磺酸組豬精子H2O2含量

3 討 論

3.1 不同濃度牛磺酸對(duì)精子活力、活率及畸形率的影響

精子的活力及活率是評(píng)定精液品質(zhì)的重要直觀指標(biāo)之一，畸形率可反映精子的運(yùn)動(dòng)與受精能力，其中尾部畸形如打結(jié)、纏繞、卷曲等對(duì)精子的影響最為明顯。Rezaee等[11]研究發(fā)現(xiàn)，牛磺酸呈濃度正依賴性地改善了雙酚A(BPA)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激小鼠的精子活力、活率及運(yùn)動(dòng)速度。本試驗(yàn)使用的負(fù)壓處理經(jīng)相關(guān)試驗(yàn)證明能夠有效減弱精子的活動(dòng)強(qiáng)度，并通過與各類抗氧化劑協(xié)同處理，進(jìn)一步提升豬精液常溫保存質(zhì)量。Li等[9]研究表明，負(fù)壓處理能夠有效提升豬精液在17 ℃保存時(shí)的活力，同時(shí)延長了保存時(shí)間。Perumal等[12]報(bào)道，牛磺酸可有效提升5 ℃保存的大額牛精子的活力及活率，牛精子相較于豬精子對(duì)低溫具有更強(qiáng)的抵抗能力，同時(shí)遭受冷打擊的程度也較低。Aly等[13]研究發(fā)現(xiàn),牛磺酸可以改善由硫丹造成的大鼠睪丸重量下降與精子活力降低，對(duì)ROS造成的谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及超氧化物歧化酶(SOD)活性減弱具有改善作用。研究表明，100 mmol/L的牛磺酸反而會(huì)降低精子活力，可能是由于較高的濃度改變了精子質(zhì)膜的通透性并破壞了精子結(jié)構(gòu)，因此不能通過直接提高濃度的方式改善牛磺酸對(duì)精子的常溫保存效果[14]，本試驗(yàn)中10 mmol/L牛磺酸組的豬精子的活力及活率出現(xiàn)一定程度的下降，推測(cè)其原因可能與此有關(guān)。本研究結(jié)果表明，向Modena稀釋劑中添加5 mmol/L牛磺酸對(duì)負(fù)壓保存豬精子的活力及活率均有良好改善作用，結(jié)果與謝東淇等[15]研究一致。本試驗(yàn)中牛磺酸對(duì)精子畸形率的改善作用較為明顯，但牛磺酸各添加組間差異在試驗(yàn)1～9 d時(shí)不明顯。5 mmol/L牛磺酸對(duì)精子畸形率有較好的抑制作用，但牛磺酸對(duì)精子畸形率的最長抑制時(shí)間及相關(guān)作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

3.2 不同濃度牛磺酸對(duì)精子動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

VAP、VCL是評(píng)價(jià)精子運(yùn)動(dòng)性能的關(guān)鍵指標(biāo)，與受精能力成正比，BCF也與精子品質(zhì)存在密切關(guān)系[16-17]。精子的各項(xiàng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)在保存過程中會(huì)不可避免地發(fā)生下降，目前向稀釋劑中添加的各類抗氧化物質(zhì)主要目的是使這種趨勢(shì)減緩，以達(dá)到延長保存時(shí)間的目的。豬精子質(zhì)膜的特殊成分比例導(dǎo)致其對(duì)氧化應(yīng)激的抵抗力較差，極易造成VAP、VSL、BCF等動(dòng)力學(xué)參數(shù)的降低，進(jìn)而削弱其與卵母細(xì)胞的結(jié)合能力。牛磺酸的抗氧化能力已經(jīng)得到廣泛驗(yàn)證，本試驗(yàn)向Modena稀釋劑中添加牛磺酸有效減緩了豬精子各項(xiàng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的降低情況，保證了其在人工授精(AI)時(shí)仍具有一定的穿卵動(dòng)力。Slanina等[18]研究表明，牛磺酸對(duì)常溫保存火雞精子VCL具有顯著改善作用。張柳明[14]研究發(fā)現(xiàn)，20 mmol/L牛磺酸可以在一定程度上改善常溫保存湖羊精子的VAP、VCL等運(yùn)動(dòng)性能參數(shù)。本研究結(jié)果顯示，5 mmol/L牛磺酸對(duì)常溫下負(fù)壓保存豬精子的VAP、VCL及BCF指標(biāo)均有顯著改善作用，能夠在一定程度上提高精子活性與受精能力。但陳寵霞等[19]發(fā)現(xiàn)，10 mmol/L牛磺酸對(duì)液態(tài)保存下家兔精子VAP指標(biāo)具有一定的改善作用。說明牛磺酸對(duì)精子的動(dòng)力學(xué)參數(shù)具有改善作用，但各物種精液保存的最適牛磺酸濃度存在差異，仍需進(jìn)一步研究與探討。

3.3 不同濃度牛磺酸對(duì)精子抗氧化能力的影響

T-AOC是反映機(jī)體抗氧化系統(tǒng)對(duì)自由基清除能力的重要指標(biāo)之一，H2O2作為非自由基ROS的重要組成部分可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激[20-21]。線粒體作為精子運(yùn)動(dòng)的動(dòng)力源，其功能強(qiáng)弱直接影響了精子運(yùn)動(dòng)性能的高低，并進(jìn)一步?jīng)Q定了精子的受精能力。細(xì)胞線粒體同時(shí)也是產(chǎn)生超氧化物的主要來源，精子在遭受氧化應(yīng)激后諸如Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)等促凋亡因子將導(dǎo)致細(xì)胞色素C(CytC)由線粒體釋放入胞質(zhì)，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)并最終發(fā)生細(xì)胞凋亡[22]。雖然本試驗(yàn)中牛磺酸表現(xiàn)出了良好的抗氧化能力，但牛磺酸保護(hù)線粒體免受氧化應(yīng)激的潛在機(jī)制仍不清楚[23]。研究表明，牛磺酸不直接參與ROS的清除，但可通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)的生成以降低氧化應(yīng)激水平[24]。Wang等[25]發(fā)現(xiàn)，牛磺酸可經(jīng)由腫瘤抑制蛋白53/細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶1(p53/Chk1)途徑有效保護(hù)紫外線處理的培養(yǎng)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激。Lou等[26]研究證實(shí)，牛磺酸通過Wnt/β-連環(huán)蛋白(Wnt/β-catenin)通路對(duì)H2O2介導(dǎo)的成骨細(xì)胞氧化損傷產(chǎn)生顯著保護(hù)作用，本試驗(yàn)中牛磺酸能夠抑制豬精液中H2O2含量的增加，通過降低精子的氧化壓力有效提升了豬精液的常溫保存質(zhì)量。Balamurugan等[27]通過負(fù)壓技術(shù)減少精液稀釋劑中的溶解氧含量后，顯著降低了冷凍保存水牛精子的ROS與LPO水平，本試驗(yàn)中采用的負(fù)壓保存技術(shù)雖與此技術(shù)路線不同，但也在一定程度上降低了精子外環(huán)境中的氧含量，對(duì)豬精子常溫保存具有積極意義。本研究結(jié)果顯示，負(fù)壓條件下5 mmol/L牛磺酸組精子的T-AOC及H2O2含量2項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于其他處理組，這與劉琦[28]研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)中T-AOC在試驗(yàn)周期內(nèi)衰減速度較快，在11 d時(shí)幾乎檢測(cè)不到，推斷牛磺酸可能對(duì)豬精子T-AOC的維持有一定局限，因此在負(fù)壓條件下添加牛磺酸常溫保存豬精子的適宜時(shí)間為9 d以內(nèi)。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，負(fù)壓條件下稀釋劑中添加5 mmol/L牛磺酸提高了常溫保存豬精子的活力及活率，并降低了畸形率，改善了精子的VAP、VCL及BCF等動(dòng)力學(xué)參數(shù)，在一定程度上提升了精子的T-AOC并顯著降低了H2O2含量，且5 mmol/L牛磺酸在負(fù)壓條件下常溫保存豬精液9 d以內(nèi)效果最佳。