抗犬細小病毒納米抗體的制備及其中和活性鑒定

任澤恒，皮雪磊，夏安然，孫 悅，胡昌輝，任桂萍

(東北農業大學生命科學學院，生物制藥實驗室，哈爾濱 150030)

犬細小病毒病是由犬細小病毒(Canine parvovirus，CPV)引起的一種急性病毒性傳染類疾病[1],其主要特征為犬出血性腸炎和非化膿性心肌炎，臨床表現為嘔吐、腹瀉、發熱和排便帶血等癥狀[2]，具有高度傳染性和致死性。研究表明，不同年齡不同性別犬均能感染，主要以幼犬最為嚴重，致死率極高[3]。CPV是一種無囊膜單鏈DNA病毒[4]，含有2個開放閱讀框(ORF)，分別編碼結構蛋白(VP1、VP2)和非結構蛋白(NS1、NS2)，其中VP2是最主要的結構蛋白[5-6]，能夠誘導中和抗體的產生。目前，犬細小病毒病以接種疫苗為主要預防方式[7]，但疫苗和臨床治療制劑存在許多缺陷，如弱毒疫苗存在毒株變異和毒力返強以及散毒的風險，母源抗體的影響會導致免疫失敗[8-10]。單克隆抗體為鼠源抗體，存在免疫排斥反應[11]等問題。因此，亟需研制治療效果顯著又安全可控的藥物。

1993年Hamers在駱駝科動物及軟骨魚類體內發現存在一種缺失輕鏈和重鏈第一恒定區(CH1)的抗體，被稱為重鏈抗體(HCAbs)[12]。經過基因編輯技術克隆重鏈抗體的可變區，得到只由1個重鏈可變區組成的單域抗體(VHH)，也被稱為納米抗體(Nb)[13]。與傳統抗體相比，Nb具有免疫原性弱、生產成本低、穩定性強等優勢，且犬源抗體相比于鼠源抗體，在治療時不需要擔心免疫排斥等副作用。因此為制備犬源抗CPV的Nb，建立犬源抗CPV pBSD-Nb抗體庫對犬細小病毒病的治療十分重要。王天宇等[14]通過建立納米抗體庫成功篩選出抗豬流行性腹瀉病毒S蛋白Nb并進行了中和效價鑒定，抗體效價可達1∶256 000。細菌展示是利用基因工程技術將外源基因與細胞間質分泌型信號肽(NlpA)進行融合表達，將外源蛋白表達在細菌內膜上[15]。N1PA信號肽可以介導外源蛋白穿過細胞，并且在穿越細胞膜的過程中，N1PA信號肽會被降解，最終留下6個氨基酸(CDQSSS)將外源蛋白錨定在細菌內膜外表面[16-17]。本研究旨在建立犬源抗CPV pBSD-Nb庫，并通過細菌展示結合流式細胞術檢測篩選出具有高親和力的Nb，為抗CPV基因工程抗體藥物篩選提供依據，也為研制中和活性全長抗體奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌Rosetta(DE3)PlysS感受態細胞、大腸桿菌DH5α感受態細胞均購自北京全式金生物技術有限公司；CPV、CPV高免比格犬脾臟、血清、Fitc標記的VP2蛋白、pBSD展示載體均由東北農業大學生命科學學院生物制藥教研室制備并保存。貓腎細胞(F81)購自中國科學院上海細胞庫(保藏號：19375.09.3101MAMGNO13)。RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司;pMD19-T、pET-27b載體均購自Novagen公司；SfiⅠ、NdeⅠ、XhoⅠ限制性內切酶、PCR試劑、T4 DNA連接酶、DL2000 DNA Marker、IPTG、溶菌酶、抗生素均購自TaKaRa公司；HRP-Sheep Anti-Dog IgG(H+L)購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 pBSD-Nb庫構建 取CPV高免比格犬的脾臟剪成小塊至預冷的研磨管中，每管1 mg，按照動物組織總RNA提取試劑盒說明書提取RNA并反轉錄合成cDNA。根據GenBank中犬重鏈可變區(VH)基因的序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物，引物信息見表1。引物均由北京擎科生物技術有限公司合成。以cDNA為模板擴增抗體庫VH基因，引入SfiⅠ酶切位點，分別對VH和pBSD載體進行SfiⅠ單酶切。利用T4 DNA連接酶將VH和pBSD載體片段4 ℃過夜連接。將PCR產物電轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂布于LB固體培養基(含有50 μg/mL氯霉素)，在37 ℃條件下培養12 h，構建pBSD-Nb庫。

表1 pBSD-Nb庫引物

1.2.2 pBSD-Nb庫篩選 挑取1.2.1中的單菌落至LB液體培養基中，37 ℃培養至D600nm值約0.4后，加0.25 mmol/L IPTG，37 ℃、120 r/min誘導4 h。誘導結束后，取1 mL培養物12 000 r/min離心1 min，棄上清；加入1 mL PBS洗滌，12 000 r/min離心1 min，棄上清；用350 μL Tris蔗糖溶液(含蔗糖0.26 μmol，Tris 0.04 mol)重懸菌體；加入35 μL新配制的溶菌酶至終濃度1 mg/mL；在渦旋振蕩儀上緩慢滴加700 μL預冷的EDTA溶液(1 mmol/L)，混勻后冰上靜置15 min；加入50 μL預冷的MgCl2溶液(0.5 mol/L)，混勻后冰上靜置10 min；12 000 r/min離心3 min，棄上清；加入1 mL PBS溶液洗滌原生質體，4 ℃、8 000 r/min離心3 min收集菌體。取90 μL的PBS重懸原生質體。向制備的原生質體中依次加入9 μL 1%牛血清白蛋白(BSA)溶液，1 μL熒光標記的VP2蛋白(FITC-VP2)，冰上避光孵育1 h，8 000 r/min離心3 min，離心后收集菌體，用PBS洗滌3次，離心后棄上清，用PBS重懸沉淀。通過流式細胞儀檢測陰性對照在488 nm波長激光下激發的熒光強度，收集樣品中熒光強度大于陰性對照的部分。提取所篩選細菌的質粒，將質粒進行電轉，完成抗體庫的構建。繼續按照上述方法對抗體庫進行2輪、3輪、4輪篩選，直至抗體庫陽性率達到80%以上。此時即可挑取固體培養基平板上的單菌落，將所挑取的單菌落分別培養，用流式細胞術逐一檢測單菌落，將獲得的陽性克隆送北京擎科生物技術有限公司測序。

1.2.3 pET27b-Nb重組質粒的構建及鑒定 根據測序結果，通過Primer Premier 5.0軟件設計測序結果正確的Nb基因的上、下游引物，上游引入NdeⅠ酶切位點，下游引入XhoⅠ酶切位點，引物序列及酶切位點序列信息見表2，引物均由北京擎科生物技術有限公司合成。對FCM檢測為陽性克隆的質粒中Nb基因片段進行PCR擴增，PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將大小約380 bp的片段切下進行膠回收。將pET27b載體和Nb基因用NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切，獲得酶切產物用T4 DNA連接酶4 ℃過夜連接。將連接產物轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞，37 ℃過夜培養，挑取單菌落鑒定正確的質粒送北京擎科生物技術有限公司進行測序。取10 ng測序正確的陽性重組質粒轉化大腸桿菌Rosetta(DE3)PlysS感受態細胞。涂布于LB固體培養基上(含50 μg/ mL 卡那霉素)，37 ℃培養12 h。

表2 Nb引物信息

1.2.4 Nb基因蛋白的表達與純化 挑取鑒定正確的大腸桿菌Rosetta(DE3)PlysS菌落接種到LB培養基中(含有50 μg/mL卡那霉素)，37 ℃、120 r/min振蕩培養4～6 h，當菌液D600 nm值達到0.4時，加入IPTG誘導劑，37 ℃、120 r/min誘導4 h，收集誘導菌，經超聲破碎后離心，分別取上清液和沉淀進行SDS-PAGE分析。取1 mL上述菌液擴大培養。4 ℃、4 000 r/min離心30 min收集誘導后菌體，用適量PBS重懸菌體，加入溶菌酶至終濃度為1 mg/mL，冰上靜置1 h后超聲破碎，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，棄上清，利用包涵體洗滌液(尿素濃度為2 mol/L)對包涵體進行洗滌，洗滌2次后，用包涵體變性液(尿素濃度為8 mol/L)重懸包涵體蛋白，將變性蛋白逐滴加入復性液(尿素濃度為2 mol/L)中。將復性后的蛋白置4 ℃ PBS溶液中透析18 h，分裝后―80 ℃保存備用。將透析后的蛋白進行SDS-PAGE分析，并用紫外分光光度計檢測，計算蛋白濃度。

1.2.5 ELISA法檢測Nb對CPV的親和力 用包被液將Nb分別稀釋至100、50、20、10、1、0.1 μg/mL，包被于96孔板，每孔100 μL，置4 ℃過夜。包被過夜后用PBST洗滌5次，每次3 min。使用5%脫脂奶粉37 ℃封閉3 h，洗滌5次后，加入CPV稀釋液100 μL，置于37 ℃孵育1 h，洗滌5次后，加入1∶9 000稀釋的抗CPV陽性血清作為一抗，37 ℃孵育1 h，洗滌5次，1∶7 500稀釋的HRP-Sheep Anti-Dog IgG(H+L)二抗中37 ℃孵育1 h，洗滌5次，加入100 μL TMB底物液避光顯色15 min，每孔加入50 μL終止液，酶標儀測定各孔D450 nm值。設置只加底物的PBS組為空白對照(N1)、未加CPV的為陰性對照(N2)、用小鵝瘟病毒(GPV)代替CPV的為條件對照(N3)。樣品及對照均設置3個重復。

1.2.6 CPV滴度測定及Nb中和活性檢測 將96孔板中的F81細胞培養至匯合度達80%，吸去上清，用DMEM將CPV按101～108梯度稀釋后加入F81細胞中，每孔100 μL，每個稀釋度設8個平行孔。同時設置只加入100 μL DMEM培養液的正常細胞為對照組，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養。每天觀察記錄細胞病變效應(CPE)。利用Reed-Muench法測定病毒的半數組織培養感染劑量(TCID50)。

將Nb按照21～29的梯度用DMEM進行稀釋，分別與100 TCID50CPV混合后37 ℃孵育1 h。將F81細胞接種到96孔細胞培養板上，培養至匯合度達80%，吸去上清，加入Nb-CPV混合液，每孔100 μL，每個稀釋度設4個平行孔。同時設置DMEM代替混合液的空白組(C1)，只加CPV病毒液代替混合液的病毒組(C2)，加抗GPV-Nb代替CPV-Nb的GPV-Nb組(C3)。將細胞置于37 ℃、5% CO2的培養箱中進行培養，每天觀察并記錄CPE，連續7 d。利用Reed-Muench法對Nb的中和效價進行測定。

1.3 數據統計與分析

用GraphPad Prism 5.0軟件進行單因素方差分析，用t檢驗進行組間差異分析。結果用平均值±標準差表示。P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 pBSD-Nb庫的鑒定

由圖1A可知，PCR擴增產物大小384 bp，與VH片段預期大小相符。由圖1B可知，利用PCR對構建的pBSD-Nb庫進行鑒定，獲得384 bp的VH片段，證明pBSD-Nb抗體庫構建成功。

M，DL2000 DNA Marker；1～8，PCR擴增pBSD-Nb庫；9、10，PCR鑒定pBSD-Nb庫

2.2 pBSD-Nb庫的篩選

流式細胞術檢測結果顯示，與陰性對照的峰(圖2A)相比，含有抗CPV-Nb菌有明顯的陽性峰，陽性菌所占的比例為23.8%(圖2B)，說明部分陽性菌表達的Nb能與VP2蛋白特異性結合。2輪、3輪、4輪篩選結果顯示，陽性菌的百分比不斷增加(圖2C～2E)。第2輪篩選，陽性原生質體比例升至41.9%(圖2C)；第3輪篩選，陽性率升至61.7%(圖2D)；第4輪篩選，陽性率達到80.1%(圖2E)。流式細胞術檢測結果表明，從50株抗體中獲得9株陽性峰偏移率較高的抗體，分別命名為Nb1、Nb2、Nb3、Nb4、Nb5、Nb6、Nb7、Nb8和Nb9(圖3)，將抗體對應的菌株進行測序后，將測序結果于NCBI網站進行Nucleotide BLAST分析，發現測序所得9個Nb序列均與GenBank上已發表的犬抗體VH具有90%的相似性。

A，陰性對照；B～E，第1～4輪篩選

A，陰性對照；B～J，Nb1～Nb9

2.3 Nb基因的克隆

由圖4可知，以篩選出的表達9株抗體的質粒為模板，PCR擴增出大小為384 bp的Nb基因特異性目的條帶，與預期的大小相符。Nb基因與pET-27b連接后，測序結果顯示與Nb原始核苷酸序列一致。

M，DL2000 DNA Marker；1～9，質粒

2.4 Nb蛋白的表達和純化

對重組質粒pET27b-Nb進行SDS-PAGE檢測，結果顯示目的蛋白主要以包涵體形式表達，Nb蛋白分子質量約14 ku(圖5)。對包涵體變性、復性、純化及透析，成功獲得并表達了目的蛋白(圖6)，純化后Nb1～Nb9蛋白的濃度依次為1.65、1.38、1.85、1.60、1.65、1.55、1.46、1.75和1.39 mg/mL。

M，蛋白質分子質量標準；1、5，未誘導陽性菌；2～4、6～11，Nb(Nb1～Nb9)誘導后的沉淀

M，蛋白質分子質量標準；1～9，純化后Nb蛋白(Nb1～Nb9)

2.5 Nb對CPV的親和力檢測

ELISA檢測結果顯示，9株抗體的親和力均極顯著高于各對照組 (P<0.01)。隨著Nb濃度的增加，反應的光密度值也呈現升高趨勢。說明這9個Nb均具有與CPV結合的能力，其中Nb1、Nb2、Nb4、Nb5、N6和Nb9對CPV的親和力較強(圖7)。

與對照組N3相比，**，差異極顯著(P<0.01)

2.6 CPV滴度測定和Nb中和活性檢測

根據Reed Muench法計算得到CPV的TCID50為10―6.4/0.1 mL。中和試驗檢測結果表明，9株Nb中有1株具有中和活性，最低有效濃度為0.05 mg/mL(表4)。

表4 Nb中和活性的測定

3 討 論

CPV于1978年在美國出現[18]，并在世界各地犬類中迅速傳播，抗CPV抗體的制備一直以來都是研究的熱點。本研究建立了pBSD-Nb庫，通過細菌展示技術結合流式細胞術對其進行了4輪篩選，成功篩選出9株可以與CPV-VP2結合的Nb。細菌展示技術利用信號肽將外源基因展示在細菌內膜外側[19]，而且錨定外源蛋白的信號肽只有6個氨基酸，對外源蛋白的構象幾乎沒有影響。細菌周質腔內的氧化性環境，保證了外源蛋白的正確折疊[20]，且可以保證蛋白的穩定性，這有利于抗原抗體的結合，保證了抗體篩選的準確性。由于細菌體積比較大，可以通過流式細胞儀進行高通量的分析和篩選，可以快速的富集陽性菌株并篩選出陽性單克隆菌株。

傳統方法制備的單克隆抗體，往往在蛋白質的N-端或C-端加入用于鑒定或純化的標志物，如His標簽等。由于其為抗體以外的短肽片段，也許會影響抗體的折疊及功能。本研究直接用無標簽的pET-27b載體在大腸桿菌中以包涵體形式表達Nb，經簡單處理后，得到純度和濃度均較高的目的蛋白，減少了去標簽純化的步驟，節約時間，降低純化損失，并且保證了蛋白能夠免受標簽的影響，正確折疊[21-23]。

雖然傳統單鏈抗體(scFv)的VH和輕鏈可變區(VL)片段在連接時的組合是隨機的，增加了抗體庫的多樣性，但也有可能由于VH和VL錯配導致scFv活性降低。同時在構建抗體文庫的時候scFv經過3次酶切和3次連接,這很有可能使產物在此過程中造成損失。本研究篩選的Nb在結構上比scFv簡單很多，它們被單基因編碼，不存在由于錯配導致活性降低的風險，并且Nb僅經過1次酶切和連接，大大降低了抗體文庫在構建過程中抗體的損失，保證了抗體文庫的多樣性。同時，Nb由于具有較小的分子結構[24]，穿透能力強，可以進入致密的組織，使其有可能結合常規抗體不能接近的抗原位點[25]。本試驗建立的pBSD-Nb庫相比于Pi等[26]建立的pBSD-scFv庫，篩選出的Nb的氨基酸序列比scFv的重復率更低，說明pBSD-Nb庫相比pBSD-scFv庫具有更高的多樣性，有更高的幾率篩選出具有中和活性的抗體，為日后篩選出更高水平抗CPV的中和抗體奠定基礎。

對比ELISA和中和試驗結果發現，對病毒具有高親和力的抗體并不一定具有中和活性。這可能是部分Nb與VP2蛋白非中和抗原表位區段結合導致的。由于無法保證抗體對病毒的親和力與中和活性的統一，這會使中和活性抗體的篩選效率降低。如果將VP2上中和抗原表位以人工合成的多肽形式進行表達并以其為“誘餌”[27]，代替本研究篩選中所使用的VP2蛋白，直接篩選出結合中和表位的高親和力抗體，即有可能實現抗體對病毒的親和力與中和活性的統一，CPV中和活性抗體的篩選效率將有可能得到提高。相比于目前一些抗CPV抗體的研究[28]，本研究成功獲得了1株高親和力且中和活性更好的抗體，其最低有效濃度為0.05 mg/mL，結果可為抗CPV Nb的制備提供理論依據。

4 結 論

本研究成功構建了抗CPV pBSD-Nb庫，篩選出9株對VP2具有高親和力的Nb，且9株Nb均可特異性結合CPV，6株親和力較強。其中1株可以阻斷CPV對F81細胞的CPE作用，其最低有效濃度為0.05 mg/mL，結果可為構建全長抗體提供參考。