牛病毒性腹瀉病毒對新西蘭白兔致病性分析及E2蛋白免疫效果的評價

趙逢淼，郭 婷，周雅坪，趙紅梅，王宇琛，田廣原，孫雅婕，卞宇晨，于佳梁，郝永清

(內蒙古農業大學，獸醫微生物學與免疫學實驗室，呼和浩特 010018)

牛病毒性腹瀉(Bovine viral diarrhea, BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)引起的疾病。主要臨床癥狀表現為流涎、呼吸急促、精神不振、食欲大減或廢絕，口腔頰部有散在潰瘍面，水樣或稀便腹瀉，糞便惡臭或有血液[1]。BVDV屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)，同屬的還有典型豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)和邊界病病毒(Border disease virus, BDV)[2]。BVDV基因組全長12.5～12.8 kb，包括5′-非編碼區(untranslated region, 5′-UTR)、3′-非編碼區(3′-UTR)和一個開放閱讀框(ORF)，編碼4種結構蛋白和8種非結構蛋白[3]。根據5′-UTR序列可將病毒分為BVDV-1、BVDV-2、BVDV-3 3個基因型[4]，此外，根據該病毒的致細胞病變能力還可分為致細胞病變型(CP型)和非致細胞病變型(NCP型)2個生物型。自1980年中國首次在吉林省發現本病并分離出病毒以來，牛病毒性腹瀉病已在中國呈普遍流行趨勢[1]。

BVDV主要感染偶蹄類哺乳動物，包括肉牛、奶牛、水牛、駱駝和鹿等[5]，這些動物價格高，不適宜作為試驗動物，因此選擇合適的替代動物對于研究BVDV致病機理、疫苗研制、疫苗保護性驗證以及藥物篩選等研究具有重要意義。目前用于BVDV研究的替代動物試驗中，Seong等[6-7]通過腹腔注射和滴鼻的方式接種3株BVDV及口服CP型BVDV感染BALB/c小鼠，結果顯示，通過腹腔注射和滴鼻方式感染的小鼠，雖在臨床上未出現明顯的病癥，但血液RT-PCR和免疫組化結果證明小鼠感染了BVDV，口服接種CP型BVDV小鼠則顯示與BVDV感染一致的病癥。Bachofen等[8]通過靜脈注射、滴鼻及采食BVDV污染干草的方式感染兔，兔淋巴器官表現出典型病毒感染的組織學變化。Grant等[9]對胎盤、母兔及后代采用BVDV特異性RT-PCR及ELISA方法檢測，結果證明BVDV可經胎盤感染兔。目前關于BVDV感染兔的致病性和動物感染模型的研究較少，兔作為BVDV感染宿主的作用尚未明晰。本研究利用滴鼻和耳緣靜脈注射BVDV的方式感染新西蘭白兔，用E2重組蛋白與佐劑混合后經肌內多點注射免疫，通過血液學、組織病理學和免疫組化等方法評估疾病進展及免疫效果，分析BVDV對感染新西蘭白兔的致病性并驗證E2重組蛋白的免疫效果，以期為BVDV致病機理和新型疫苗的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

20只健康的體重為1.5～2 kg的3月齡雌性新西蘭白兔購自北京興隆實驗動物養殖場；BVDV-1 MCD分離株、BVDV E2蛋白(大腸桿菌表達系統)均由內蒙古農業大學獸醫學院微生物學與免疫學實驗室分離/克隆表達并保存；牛腎上皮細胞(MDBK)、DMEM細胞培養液均購自Gibco公司；總RNA極速抽提試劑盒購自上海飛捷生物技術有限公司；EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉錄試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；兔抗牛IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP、BCA法蛋白濃度測定試劑盒、ELISA酶標板均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；BVDV牛標準陰、陽性血清購自中國獸藥監察所；TMB顯色液購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 BVDV的純化及病毒滴度的測定

將濃度為10%、20%、30%、40%、50%的蔗糖溶液由高濃度至低濃度緩慢加入到超速離心管中，再將BVDV-1 MCD病毒液緩慢加在液面的最上層，30 000×g離心12 h，離心后可見1條清晰的乳白色病毒條帶，將上層蔗糖溶液吸棄，沿離心管壁吸出乳白色病毒液即為純化的病毒。將病毒液用DMEM培養基10倍梯度稀釋(10-1至10-8)，接種于96孔培養板中MDBK,其中每個稀釋度接種8孔，每孔100 μL，同時設細胞對照組，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每天觀察并記錄細胞病變情況，按照Reed-Muench法計算BVDV的病毒滴度。

1.3 BVDV對新西蘭白兔致病性分析

1.3.1 新西蘭白兔感染BVDV及樣品采集 將10只新西蘭白兔隨機分為感染組和對照組，每組5只。在常規條件下飼養7 d后，取適量乙醚將新西蘭白兔麻醉，感染組每只接種純化病毒液1 mL[8](此時記為1 d)，其中滴鼻500 μL、耳緣靜脈注射500 μL；對照組分別用500 μL生理鹽水滴鼻和注射，連續3 d，每天1次，每天上午觀察新西蘭白兔臨床癥狀并測量體溫。在感染后第6、9、12、15、17天通過耳緣靜脈采集新西蘭白兔血液于加抗凝劑(EDTA)的采血管中。第17天剖殺所有兔，在剖殺前采集鼻拭子，剖殺后分別采集氣管、肺臟、小腸、脾臟并用10%福爾馬林固定。

1.3.2 RT-PCR鑒定BVDV感染情況 BVDV PCR引物參考王媛媛等[10]研究，引物序列：上游引物：5′-GRAGTCGTCARTGGTTCGAC-3′；下游引物：5′-TCAACTCCATGTGCCATGTAC-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。將新西蘭白兔鼻拭子用DMEM培養液沖洗、震蕩后，12 000×g離心10 min，提取上清液RNA并反轉錄合成cDNA進行PCR鑒定，陽性對照為BVDV在MDBK中培養提取的RNA，陰性對照為ddH2O。PCR反應體系25 μL：GreenTaqMix 7.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA模板3 μL，ddH2O 12.5 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.3.3 血常規測定 分離采集的感染后第6、9、12、15、17天的新西蘭白兔血清，使用全自動血細胞分析儀(BC-2600 Vet，邁瑞醫療器械有限公司)進行血常規檢測，包括白細胞(WBC)、淋巴細胞(LYM)、血小板(PLT)。

1.3.4 組織病理學檢測 將10%福爾馬林中固定24 h以上的氣管、肺臟、脾臟、小腸組織取出，用50%、70%、80%、95%、無水乙醇(2次)將固定的各組織進行脫水處理，脫水后使用二甲苯進行組織透明，然后浸蠟包埋，將包埋好的組織進行切片、貼片、脫蠟等操作，進行HE染色，染色后的切片經無水乙醇脫水，再經二甲苯使切片透明，封固后鏡檢觀察新西蘭白兔各組織的病變情況。

1.4 BVDV E2蛋白免疫原性效果評價

1.4.1 新西蘭白兔免疫攻毒及樣品采集 將10只新西蘭白兔隨機分為免疫組和對照組，每組5只。在常規條件下飼養7 d后，耳緣靜脈采血，制備免疫前兔血清。用E2重組蛋白進行免疫，一免使用弗氏完全佐劑，將純化E2重組蛋白(2 mg/mL)與弗氏完全佐劑1∶1混勻，用漩渦混合器震蕩30 min進行乳化，免疫組兔肌內注射1 mL，對照組注射等體積生理鹽水；一免后14 d進行二免；二免用弗氏不完全佐劑，免疫劑量及操作過程同一免，對照組同樣注射等體積生理鹽水。分別于一免后第7、14、21、28天經耳緣靜脈采血，分離血清。一免后28 d攻毒。攻毒程序同1.3.1。感染17 d后剖殺所有兔，在剖殺之前采集氣管鼻拭子，剖殺后分別采集氣管、肺臟、小腸、脾臟用10%福爾馬林固定。

1.4.2 抗體間接ELISA檢測 用間接ELISA法檢測一免前及一免后第7、14、21、28天血清的抗體水平。具體步驟如下：取96孔ELISA板，每孔加入100 μL 2 μg/mL E2蛋白4 ℃包被過夜；PBST洗3次，每次5 min，加10% PEG4000于37 ℃封閉2 h；PBST洗3次，每次5 min；將血清按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024、1∶2 048、1∶4 096稀釋后，BVDV標準陰性、陽性血清按1∶100稀釋后，分別加入包被好的ELISA板孔內，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，PBST洗3次，每次5 min；山羊抗兔IgG-HRP (1∶4 000)二抗37 ℃孵育1 h，PBST洗3次，每次5 min；用20% TMB顯色10 min，用2 mol/L H2SO4終止反應。測定D450 nm值。

1.4.3 RT-PCR鑒定BVDV感染情況 將新西蘭白兔鼻拭子用DMEM培養液沖洗、震蕩后，12 000×g離心10 min，吸取上清液進行PCR鑒定，鑒定程序同1.3.2。

1.4.4 組織病理學檢測 將10%福爾馬林中固定24 h以上的氣管、肺臟、脾臟、小腸組織取出，制備各組織病理切片并觀察病變情況，操作步驟同1.3.4。

1.4.5 免疫組織化學檢測 用75%、85%、90%、95%、無水乙醇(2次)將氣管、肺臟、脾臟、小腸等組織進行脫水，無水乙醇與二甲苯1∶1混合液透明處理，石蠟浸蠟與包埋，將包埋好的組織進行切片、烤片、切片脫蠟，將脫蠟后的組織切片置于修復液(0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液，pH 6.0)(0.01 mol/L EDTA緩沖液，pH 9.0)中修復10～15 min，進行抗原修復，用3%過氧化氫室溫孵育15 min以阻斷內源性過氧化物酶，5%山羊血清封閉，一抗BVDV標準陽性血清(1∶100)4 ℃過夜孵育，PBS洗3次，兔抗牛IgG(1∶50)二抗孵育1 h，DAB顯色液顯色，蘇木精復染后封片，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 數據統計分析

采用GraphPad Prism 6.0軟件進行獨立樣本t檢驗分析并作圖，結果表示為平均值±標準差。P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 BVDV新西蘭白兔感染試驗結果

2.1.1 BVDV的病毒滴度測定結果 根據Reed-Muench法計算得到BVDV的病毒滴度為4.16×106TCID50/mL。

2.1.2 臨床癥狀及體溫的測定結果 BVDV感染組部分新西蘭白兔6 d內活動減少，采食略微減少，6 d后逐漸恢復正常，在接種第13天出現腹瀉癥狀。接種病毒后第5天新西蘭白兔體溫開始略微升高，但均在正常范圍內波動，對照組新西蘭白兔體溫正常(圖1)。

圖1 各組新西蘭白兔體溫變化

2.1.3 BVDV的RT-PCR鑒定結果 由圖2可知，5只感染組新西蘭白兔鼻拭子均擴增出大小為199 bp的條帶，5只對照組新西蘭白兔鼻拭子均未檢測到該目的條帶。

M，DL2000 DNA Marker；1～5，感染組鼻拭子培養物；6～10，對照組鼻拭子培養物；11，陽性對照；12，陰性對照

2.1.4 血常規測定結果 由圖3可知，與對照組相比，感染組白細胞在攻毒第6和9天顯著降低(P<0.05)，在攻毒第12、15和17天極顯著降低(P<0.01)；感染組血小板數量在所有檢測時間均極顯著降低(P<0.01)；感染組淋巴細胞數量在攻毒第12、15和17天均極顯著降低(P<0.01)。

2.1.5 組織病理結果 感染組氣管上皮細胞有明顯水泡樣變性，并有散在壞死，出現核濃縮(圖4A)；對照組氣管黏膜層完整，結構清晰，上皮完整，未見病變(圖4B)；感染組肺臟肺間質可見淋巴細胞增生和浸潤，特別是血管細支氣管周圍淋巴細胞呈小灶狀，呈彌散性浸潤，多數肺組織間質增寬，呈典型輕到中度間質性肺炎，有Ⅱ型上皮細胞增生，炎灶邊緣可見代償性肺氣腫(圖4C)；對照組支氣管、肺泡無明顯炎癥反應，結構清晰(圖4D)；感染組脾臟白髓體積增大，有淋巴細胞增生，生發中心有散在的淋巴細胞核濃縮及破裂，紅髓淋巴細胞數量增多(圖4E)；對照組白髓和紅髓結構清晰完整，未見病變(圖4F)；感染組小腸黏膜上皮細胞有脫落，但無壞死，較為完整，固有層可見明顯淋巴細胞浸潤(圖4G)；對照組腸壁結構完整，層次清晰，絨毛上皮細胞完整，無明顯病變(圖4H)。

①A，感染組氣管(200×)；B，對照組氣管(200×)；C，感染組肺臟(200×)；D，對照組肺臟(100×)；E，感染組脾臟(200×)；F，對照組脾臟(100×)；G，感染組小腸(200×)；H，對照組小腸(100×)。②箭頭代表病變

2.2 新西蘭白兔免疫效果評價試驗結果

2.2.1 新西蘭白兔抗體間接ELISA檢測結果 間接ELISA檢測表明，在7 d時，免疫組新西蘭白兔血清抗體滴度為1∶16～1∶32；在一免后28 d時抗體滴度明顯升高，達到1∶256～1∶512(圖5)。

圖5 新西蘭白兔特異性抗體檢測結果

2.2.2 BVDV的RT-PCR鑒定結果 5只對照組新西蘭白兔鼻拭子均擴增出大小為199 bp的條帶，5只免疫組新西蘭白兔鼻拭子均未檢測到該目的條帶(圖6)。

M，DL2000 DNA Marker; 1～5，對照組鼻拭子培養物; 6～10，免疫組鼻拭子培養物; 11，陽性對照; 12，陰性對照

2.2.3 組織病理學結果 免疫組氣管上皮完整，纖毛明顯，黏膜上皮胞漿內有可見小空泡(圖7A)；對照組氣管上皮細胞有水泡樣變性，且有散在壞死(圖7B)；免疫組肺臟局部肺泡間隔輕度增寬，大細支氣管周圍可見淋巴細胞增生結節(圖7C)；對照組肺臟呈典型中度間質性肺炎，肺泡細胞周圍有大量炎性細胞增生，有Ⅱ型上皮細胞增生，炎灶邊緣可見代償性肺氣腫(圖7D)；免疫組脾臟紅髓白髓界限明顯，未見病變(圖7E)；對照組脾臟白髓體積增大，紅髓淋巴細胞數量增多(圖7F)；免疫組小腸粘膜上皮細胞有脫落，但無壞死，較為完整，未見病變(圖7G)；對照組小腸上皮有些許脫落，但無壞死(圖7H)。

①A，免疫組氣管(200×)；B，對照組氣管(200×)；C，免疫組肺臟(100×)；D，對照組肺臟(200×)；E，免疫組脾臟(100×)；F，對照組脾臟(100×);G，免疫組小腸(100×)；H，對照組小腸(40×)②箭頭代表病變

2.2.4 免疫組化結果 對照組氣管、肺臟、脾臟、小腸中均能檢測到陽性信號，免疫反應產物為黃色，間質清晰，無背景著色(圖8B、8D、8F、8H)；免疫組氣管、肺臟、脾臟、小腸免疫組化結果均為陰性(圖8A、8C、8E、8F)。

①A，免疫組氣管；B，對照組氣管；C，免疫組肺臟；D，對照組肺臟；E，免疫組脾臟；F，對照組脾臟；G，免疫組小腸；H，對照組小腸。②箭頭為陽性信號

3 討 論

目前中國BVDV的防控形勢十分嚴峻，牛重點養殖區域均存在BVDV感染，并有愈演愈烈的趨勢[11]。牛是BVDV典型的宿主，但并不局限于這種宿主，人們普遍認為BVDV不易感非偶蹄類動物，但一系列試驗證明兔能感染BVDV[8-9]，而且兔作為BVDV試驗動物的作用仍存疑慮，因此進一步了解兔感染BVDV是十分必要的。

卜凡亮等[12]對家兔采用腹腔注射方法進行BVDV感染，RT-PCR檢測感染組血清、淋巴結、脾臟等均為陽性，表明人工感染家兔成功，但BVDV河南分離株感染家兔后除了體溫變化外并無特征性臨床癥狀和明顯病變；邢思毅等[13]對泌乳兔采用滴鼻攻毒、口腔灌胃攻毒和靜脈注射等方法感染BVDV，感染7 d內在腸道黏膜均可檢測到BVDV，說明BVDV感染泌乳兔產生致病性作用。以上試驗的結果不同可能是由于感染途徑、病毒劑量以及試驗兔品種差異引起的。在2014年，Bachofen等[8]證實新西蘭白兔可通過靜脈注射感染BVDV，采食被BVDV污染的干草也可感染，在其大多數器官均檢測到了BVDV，且淋巴組織出現了典型病變。因此，為了進一步確定兔作為BVDV宿主的適用性，了解兔作為BVDV感染宿主的作用，本研究將純化的BVDV病毒液以滴鼻500 μL和耳緣靜脈注射500 μL的方式人工感染新西蘭白兔，盡管受感染的新西蘭白兔只表現出輕微的臨床癥狀，但RT-PCR結果顯示，感染組5只新西蘭白兔鼻拭子樣品為陽性，血液學檢測結果表明感染組白細胞、血小板和淋巴細胞數量降低，組織病理學觀察顯示感染組氣管、肺臟、脾臟及小腸表現出輕度至重度的組織病理學變化，均表明BVDV成功感染新西蘭白兔。BVDV急性感染能夠引起白細胞、淋巴細胞、血小板減少的能力已經在一些研究中報道[7,14-15]，與本研究結果相似。綜上所述，滴鼻加耳緣靜脈注射CP型BVDV可導致新西蘭白兔與上述研究中BVDV感染一致的變化，如病毒抗原的出現，血液學和組織病理學的變化。說明新西蘭白兔感染BVDV可能導致血小板產生減少或加速破壞。

E2蛋白在免疫應答過程中起著極其重要作用，是BVDV引起免疫反應活性的重要保護性抗原，是基因工程疫苗的首選保護性抗原。吳桐忠等[16]重組乳酸菌表達的E2蛋白以及王遵寶等[17]利用昆蟲細胞-桿狀病毒系統表達的E2蛋白均能起到較好的免疫作用。本研究對E2重組蛋白(大腸桿菌表達系統)免疫原性進行驗證，結果表明，免疫組新西蘭白兔鼻拭子經RT-PCR檢測為陰性,初步驗證了E2亞單位疫苗能對BVDV起到免疫防御作用；通過對免疫攻毒組與對照組組織病理切片觀察對比，E2基因工程亞單位疫苗免疫后能夠有效保護新西蘭白兔氣管、肺臟、脾臟和小腸等器官免受BVDV的損傷；通過間接ELISA方法進行血清學抗體滴度的檢測，在免疫期第7天即可檢測到抗體水平的增加，在第28天達到較高水平，表明BVDV E2亞單位疫苗可以成功引起新西蘭白兔機體的免疫應答反應；在免疫效果評價試驗中，免疫組化結果顯示免疫組各組織切片均未檢測到陽性信號，而對照組新西蘭白兔出現了明顯的陽性信號。表明BVDV E2亞單位疫苗能夠起到很好的免疫保護作用。

4 結 論

本試驗結果表明，BVDV可以成功感染新西蘭白兔，感染兔出現體溫略微升高，活動減少，輕微腹瀉等臨床癥狀，氣管、肺臟、脾臟和小腸等組織出現輕度至重度的病理學變化，白細胞、淋巴細胞、血小板含量均顯著或極顯著降低；E2重組蛋白免疫兔后能產生BVDV特異性中和抗體并減輕組織損傷，說明E2重組蛋白可在兔上產生有效的保護作用。