青蒿素與牛病毒性腹瀉病毒NS5B蛋白的分子對接預測及其抗病毒作用

邵百卉，姜東君，謝藝萌，劉思雨，邵子益，張澤財，2，計 紅，朱戰波,2

(1.黑龍江八一農墾大學動物科技學院，大慶 163319；2.黑龍江省牛病防控工程技術研究中心,大慶 163319；3.濟寧醫學院精神衛生學院，山東省行為醫學重點實驗室，濟寧 272067)

牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)為黃病毒科瘟病毒屬的成員之一，是單鏈正股的RNA病毒。BVDV在世界范圍內廣泛分布，并造成嚴重的經濟損失[1]。BVDV感染可引起牛的多種疾病，包括呼吸道、消化道和生殖系統疾病，母牛妊娠50～150 d感染BVDV產出的持續性感染牛(PI牛)被認為是該病最重要的傳染源[2]。BVDV基因組長度為12.3～12.5 kb，含有1個由5′-和3′-非翻譯區(UTRs)組成的大開放閱讀框(ORF)。編碼最終蛋白產物為結構蛋白C、Erns、E1、E2和非結構蛋白Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B組成[3]。NS5B位于多蛋白的羧基末端，在瘟病毒中高度保守，并被證實具有RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)活性，主要負責病毒基因組的轉錄和復制。由此，可能成為開發抗BVDV藥物的理想靶標[4]。20世紀60年代，在歐洲某些國家的奶牛和肉牛中該病毒的檢出率為53%～73%，而發展到20世紀90年代后，BVDV的檢出率居然高達90%以上。近年來在國內BVDV的陽性檢出率逐年上升[5]。為了使BVDV的感染在全世界得到有效控制，國內外很多學者對該病毒做了全面深入的研究，但仍然沒有有效的疫苗或可選擇的抗病毒藥物[6]，因此，進行天然藥物成分抗病毒作用的研究顯得尤為重要[7-8]。

青蒿素是從植物黃花的蒿莖葉中提取出的含過氧基團的倍半萜內酯類天然小分子，同時也是高效低毒的抗瘧藥之一[9]。青蒿素具有廣泛的生物活性，已在瘧疾治療中取得世界矚目的成果，近期研究也表明青蒿素在對抗病毒感染誘導的炎癥反應和某些癌癥的治療方面具有潛在的生物活性[10]。目前，已有很多中藥應用于抗病毒中，如松花粉多糖可有效抑制病毒的黏附，還能顯著降低免疫器官的病毒載量，改善免疫抑制，板藍根作用于病毒的黏附和復制過程，能在一定程度上減輕炎癥反應，黃芪多糖，槐樹多糖和川明參多糖等均可以通過促進細胞因子的分泌，激活免疫通路、增強免疫系統功能來發揮抗病毒作用[11]；冰香散在最低無毒濃度下即可表現出預防和直接抑制體外流感病毒復制的作用[12]。就目前研究來看，青蒿素對黃病毒科中BVDV和丙型肝炎病毒具有抗病毒效果，但有關抗病毒機制方面的研究鮮見報道。本研究擬采用分子對接的方法預測青蒿素與BVDV NS5B的相互作用，在初步預測的基礎上，應用MDBK細胞確定青蒿素對BVDV體外復制的影響，為進一步研究青蒿素的抗病毒活性及其抗病毒機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及毒株 MDBK(CCL-22)細胞和NADL株BVDV(CP型)均由黑龍江八一農墾大學牛病防治工程技術中心實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 青蒿素提取物購于成都曼斯特生物公司，純度>98%，藥品均配制成濃度為200 μmol/L的儲備液，4 ℃保存，使用時用無血清的DMEM培養基稀釋成所需濃度。DMEM培養液和胎牛血清均購于四季青試劑公司；CCK-8細胞活性檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；逆轉錄試劑盒、SYBR熒光定量RT-PCR試劑盒購于TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 結構預處理 青蒿素結構(MOL007424)源自TCMSP數據庫(http:∥lsp.Nwuedu.cn/tcmsp.Php)，通過PyMOL軟件轉換成PDB結構；BVDV-NS5B受體蛋白(PDBID：1S48)源自蛋白質數據庫(http:∥www.Rcsb.org/pdb)，下載得到FASTA Sequence結構，通過SWISS-MODEL進行同源建模(https:∥swissmodel.expasy.org/)，獲得并下載該蛋白，轉換成PDB晶體結構。模擬對接前蛋白分子和藥物小分子均通過Autodock Tools1.5.6進行加氫、減電荷及非極性氫鍵結合處理，保存成PDBQT文件。

1.2.2 Autodock分子對接 將處理完畢的配體分子(青蒿素)和受體分子(BVDV-NS5B)用Autodock軟件進行分子對接，設置格點間隔值。設置Grid參數，x為118，y為108，z為90，運行程序進行對接。用Autodock軟件分析生成對接的.dlg文件，根據結合能等情況選擇結合能最低的結合構象并保存成.PDBQT文件。通過PyMOL軟件對其分子構象進行Cartoon展示并生成圖片。

1.2.3 青蒿素對細胞毒性的測定 采用CCK-8試劑盒對不同濃度青蒿素作用于MDBK細胞后的細胞毒性進行測定。將生長狀態良好的MDBK細胞按照每孔100 μL(1×105/mL)接種到96孔細胞培養板，待細胞長到匯合度為80%時，棄掉營養液并用PBS洗滌3次。隨后，用DMEM培養液把青蒿素儲備液(200 μmol/L)稀釋為11個不同濃度：0(對照組)、2.5、5、10、20、40、60、80、100、150、200 μmol/L，每個濃度設4個重復孔，每孔加入100 μL藥物稀釋液，并設置4個空白對照孔(不加細胞和藥物，只有培養液)。置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，72 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，培養2 h后，用酶標儀測定450 nm處的吸光度(D)值。

依據公式：細胞存活率(%)=(D450 nm藥物組-D450 nm空白對照組)/(D450 nm細胞對照組-D450 nm空白對照組)×100%，計算MDBK細胞在不同濃度下青蒿素的細胞存活率。

1.2.4 青蒿素體外抗BVDV活性試驗 MDBK細胞處理同1.2.3。根據青蒿素對MDBK細胞毒性的檢測結果，用細胞維持液以青蒿素最適濃度為基準進行2倍梯度稀釋，依次稀釋成5個濃度備用；各試驗組使用感染復數(MOI)為0.1的劑量接種BVDV病毒液，同時設置正常細胞對照組、病毒對照組(0 μmol/L青蒿素)、空白對照組，每組均做4個重復孔。根據藥物與病毒添加的先后順序探究藥物抑制作用、預防作用和殺滅作用。其中藥物抑制試驗是在各試驗組每孔先接種上述劑量的BVDV 2 h后棄去，再加入200 μL不同濃度的藥物；藥物預防試驗是在各試驗組每孔加入200 μL不同濃度的藥物作用4 h后棄去，再接種上述劑量的BVDV作用2 h后棄去，再在每孔加入200 μL不同濃度的藥物；藥物殺滅作用是在各試驗組每孔中同時添加不同濃度的藥物溶液與等體積病毒液的混合液200 μL，作用4 h后棄去，每孔再加入200 μL不同濃度的藥物。放置培養箱作用并逐日觀察病變，待出現明顯病變時向各孔中加入20 μL的CCK-8溶液，隨后置于37 ℃、5% CO2培養箱中作用2 h,用酶標儀進行細胞活性的檢測，按照1.2.3中方法計算各組的細胞存活率。

1.2.5 藥物對 BVDV復制的影響 確定了3種不同方式下青蒿素抗BVDV的最佳濃度后，按照藥物體外抑制BVDV、藥物體外預防BVDV和藥物體外殺滅BVDV 3種作用方式開展試驗，每孔加入MOI為0.1的BVDV病毒液，并設置病毒對照組。在48 h以及72 h時提取各組總RNA，通過逆轉錄反應合成cDNA，作為模板，進行SYBR Green 法熒光定量技術檢驗。BVDV引物序列為：F：5′-GAGT-ACAGGGTAGTCGTCAG-3′;R：5′-CTCTGCAG-CACCCTATCAGG-3′(引物為黑龍江八一農墾大學牛病防治工程技術中心實驗室保存)。預期擴增長度為130 bp。PCR反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環，根據標準曲線計算出其病毒載量。

1.2.6 數據統計分析 數據采用SPSS 25.0統計學軟件處理。試驗結果以平均值±標準差表示，組間兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，P>0.05表示差異不顯著；P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 青蒿素與BVDV-NS5B對接分析結果

結果表明，通過蛋白質數據庫收集到的BVDV-NS5B受體蛋白(PDBID：1S48)存在潛在作用靶點，通過TCMSP數據庫收集到青蒿素的配體結構，進行分子對接找到藥物與BVDV NS5B蛋白結合的“分子口袋”。經過模擬篩選以及Autodock軟件進行運算分析，最終得到10個分子和對應的打分(表1)。結果表明，青蒿素位點1與BVDV-NS5B結合后的結構最穩定，結合自由能為-28.6748 kJ/mol。圖1為青蒿素位點1與BVDV-NS5B的結合圖，提示青蒿素可能具有抑制BVDV活性的功能。

表1 青蒿素與BVDV-NS5B不同對接位點的結合能

圖1 青蒿素與BVDV-NS5B結合圖

2.2 青蒿素對細胞的毒性試驗

由圖2可知，作用72 h后，與0 μmol/L青蒿素處理(對照組)相比，2.5、5、10、20、40、60、80 μmol/L青蒿素處理組MDBK細胞存活率均極顯著提高(P<0.01)，而100、150、200 μmol/L青蒿素處理后的細胞存活率與0 μmol/L 青蒿素處理后的存活率變化幅度相對較小。最大安全濃度應選擇濃度低且對細胞活性影響較小的濃度，故選定100 μmol/L青蒿素為最大安全濃度。

與對照組相比，*，差異顯著(P<0.05);**,差異極顯著(P<0.01)。下同

2.3 青蒿素抗BVDV效果

2.3.1 青蒿素對BVDV的抑制作用 在上述試驗基礎上，將青蒿素依次稀釋為100、50、25、12.5、6.25 μmol/L進行后續試驗。在先加病毒再加藥的給藥方式下，細胞觀察結果顯示，試驗組與病毒對照組相比，細胞病變的程度均有所減輕。由圖3A可知，青蒿素添加濃度為100、50、25、12.5 μmol/L時MDBK細胞存活率均在50%以上，且極顯著高于病毒對照組(P<0.01)，其中濃度為100 μmol/L時抑制作用最為顯著，細胞存活率高達71%，表明該作用方式下青蒿素對BVDV有較強抑制作用。

2.3.2 青蒿素對BVDV的預防作用 在先加藥再加病毒的給藥方式下，觀察發現，試驗組與病毒對照組相比，細胞病變的程度均有所減輕。由圖3B可知，與病毒對照組相比，5個濃度水平的青蒿素均能極顯著提高MDBK細胞的存活率(P<0.01)，其中青蒿素濃度為100 μmol/L時，預防作用最為顯著，細胞存活率達到了68%。

2.3.3 青蒿素對BVDV的殺滅作用 由圖3C可知，在藥物與病毒同時作用的給藥方式下，各加藥組的細胞存活率較病毒對照組均極顯著提高(P<0.01)。5種不同濃度的青蒿素對BVDV均表現出有一定的殺滅作用，且在安全濃度范圍內，呈一定的量效關系。相比青蒿素的其他濃度組，100 μmol/L濃度組MDBK細胞的存活率最高(58%)。

A，抑制作用；B，預防作用；C，殺滅作用

綜合3種作用方式，均在青蒿素濃度為100 μmol/L時抗BVDV效果最為顯著，所以青蒿素對BVDV的最佳作用濃度為100 μmol/L。

2.4 青蒿素對 BVDV 復制的影響

在3種作用方式檢測青蒿素作用于MDBK細胞后BVDV的復制水平，如圖4所示，當先加病毒后加藥物時，同病毒對照組相比，48 h抑制組與72 h抑制組均可極顯著降低BVDV在細胞中的表達量(P<0.01)，同72 h抑制組相比，48 h抑制組的抑制作用更為顯著。先加藥物后加病毒時(預防作用)，與病毒對照組相比，48與72 h預防組均能極顯著降低病毒表達量(P<0.01)，其中72 h的藥物預防作用更為顯著。當藥物與病毒1∶1同時加入時，同病毒對照組相比，48與72 h殺滅組均可極顯著減少病毒在細胞中的復制(P<0.01)，但同預防組與抑制組相比，對BVDV復制效果影響相對較小。綜合3種方式，后給藥物體外培養48 h時青蒿素對BVDV復制的抑制作用更明顯，可大幅度降低BVDV拷貝數。

1，病毒對照組；2，48 h；3，72 h

3 討 論

在臨床應用中，對于病毒性疾病的治療藥物篩選一直存在技術瓶頸，抗病毒特效藥物缺乏且存在不良反應，中草藥因其獨特的作用機制，不易產生耐藥性且毒副作用小而受到廣泛的關注。目前，牛病毒性腹瀉的防控仍然是全球養牛業的難題，臨床上亟需能有效抑制BVDV的藥物。在新藥研發過程中，應用虛擬篩選可以富集活性化合物，降低篩選成本，提高藥物篩選的可行性，因此已成為新藥研發的重要方法。自20世紀70年代中期首次出現以來，分子對接已經成為一種獨特的輔助藥物設計和發現的計算機工具[13]。據報道，青蒿素對于RNA病毒具有不同程度的抗病毒效果，對部分黃病毒有良好的抑制作用[9]，但是對于BVDV，目前鮮見相關研究報道，其中藥物的抗病毒機制也不夠明晰。本研究探索了青蒿素對黃病毒科中BVDV的抗病毒效果。分子對接結果顯示，青蒿素與BVDV-NS5B蛋白存在相互作用，青蒿素中的10個活性位點均可與BVDV NS5B有機結合，通過打分結果可找到小分子配體與生物靶標大分子結合的最優構象，預測出2個分子之間最佳的結合模式，最后將最佳配體進行實體藥物篩選，可能篩選出具有活性的先導化合物。青蒿素活性位點1與BVDV-NS5B結合時的自由能為-28.6748 kJ/mol，結合的自由能較低，推測構象穩定，與受體結合的親和力強，對蛋白質受體可能具有抑制活性，需要進一步驗證。

篩選藥物的方法主要有體外試驗和體內試驗，中藥的成分極其復雜，干擾體內試驗的因素較復雜，故很難深入清楚了解藥物作用的本質以及導致各種變化的細節、規律，而體外試驗可以了解藥物的作用規律并分析細節，可重復性高。目前，CCK-8試劑盒是MTT比色法的升級替代品，比MTT更加穩定，對細胞毒性極小，測試結果更加穩定，更加敏感[14-15]。因此采用CCK-8試劑盒進行細胞毒性試驗和抗病毒藥效學試驗，可更客觀地評價藥物的抗病毒作用[15]。不同濃度的青蒿素處理MDBK細胞后均維持了較高的細胞存活率，說明青蒿素藥物本身對MDBK細胞無毒性，部分濃度甚至可以促進細胞生長，但為了減少藥物對細胞生長率的影響以及節約成本，故選取對MDBK細胞影響較小且較低的濃度進行后續試驗。青蒿素在體外對BVDV復制的影響結果表明，青蒿素對MDBK細胞的最大安全濃度為100 μmol/L，進一步發現3種作用方式下青蒿素對BVDV均有抑制作用，研究采用SYBR Green 法熒光定量技術檢測了BVDV在細胞中的水平，結果提示3種作用方式中藥物抑制組效果最佳，對病毒復制有極顯著的抑制作用，推測其抗病毒的主要效應可能是青蒿素進入細胞內抑制了BVDV的復制或直接殺滅游離的BVDV而發揮作用，其確切的作用機理有待進一步的深入研究。

中國的傳統中醫藥有著很長的發展歷史，在抗病毒研究領域中已取得很大進展[16]。已有研究發現，訶子提取物對1型艾滋病病毒 (HIV-1)具有抑制作用[17]，甘青烏頭提取物可抑制單純皰疹病毒Ⅱ型(HSV-2)病毒[18]，二萜生物堿可明顯抑制甲型H1N1流感病毒 (H1N1)[19]，紫堇屬成分具有抗病毒作用[20]。研究表明，中藥單體或復方可以通過調節機體免疫實現對BVDV的抑制[21]。然而，目前國內對抗BVDV的中藥研究基本停留在細胞水平上。另外，由于中藥制劑成分繁多，藥理作用復雜，作用靶點眾多，抗病毒的分子機制仍難以明確[22-23]。本研究發現單一使用青蒿素具有抗BVDV復制的作用，若聯合用藥可能更好抑制BVDV的復制，但需要結合體內試驗進行綜合評價，中藥單體或復方抗BVDV的分子機制仍是需要解決的科學問題。

4 結 論

本研究利用分子對接技術初步確定了青蒿素與BVDV-NS5B的互作關系，并發現BVDV感染MDBK細胞后給予100 μmol/L的青蒿素作用48 h，其對BVDV復制的抑制作用最強，為抗BVDV藥物開發提供了新思路。