青蒿素與牛病毒性腹瀉病毒NS5B蛋白的分子對接預(yù)測及其抗病毒作用

邵百卉，姜東君，謝藝萌，劉思雨，邵子益，張澤財，2，計 紅，朱戰(zhàn)波,2

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江省牛病防控工程技術(shù)研究中心,大慶 163319；3.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院精神衛(wèi)生學(xué)院，山東省行為醫(yī)學(xué)重點實驗室，濟(jì)寧 272067)

牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)為黃病毒科瘟病毒屬的成員之一，是單鏈正股的RNA病毒。BVDV在世界范圍內(nèi)廣泛分布，并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。BVDV感染可引起牛的多種疾病，包括呼吸道、消化道和生殖系統(tǒng)疾病，母牛妊娠50～150 d感染BVDV產(chǎn)出的持續(xù)性感染牛(PI牛)被認(rèn)為是該病最重要的傳染源[2]。BVDV基因組長度為12.3～12.5 kb，含有1個由5′-和3′-非翻譯區(qū)(UTRs)組成的大開放閱讀框(ORF)。編碼最終蛋白產(chǎn)物為結(jié)構(gòu)蛋白C、Erns、E1、E2和非結(jié)構(gòu)蛋白Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B組成[3]。NS5B位于多蛋白的羧基末端，在瘟病毒中高度保守，并被證實具有RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)活性，主要負(fù)責(zé)病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。由此，可能成為開發(fā)抗BVDV藥物的理想靶標(biāo)[4]。20世紀(jì)60年代，在歐洲某些國家的奶牛和肉牛中該病毒的檢出率為53%～73%，而發(fā)展到20世紀(jì)90年代后，BVDV的檢出率居然高達(dá)90%以上。近年來在國內(nèi)BVDV的陽性檢出率逐年上升[5]。為了使BVDV的感染在全世界得到有效控制，國內(nèi)外很多學(xué)者對該病毒做了全面深入的研究，但仍然沒有有效的疫苗或可選擇的抗病毒藥物[6]，因此，進(jìn)行天然藥物成分抗病毒作用的研究顯得尤為重要[7-8]。

青蒿素是從植物黃花的蒿莖葉中提取出的含過氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯類天然小分子，同時也是高效低毒的抗瘧藥之一[9]。青蒿素具有廣泛的生物活性，已在瘧疾治療中取得世界矚目的成果，近期研究也表明青蒿素在對抗病毒感染誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和某些癌癥的治療方面具有潛在的生物活性[10]。目前，已有很多中藥應(yīng)用于抗病毒中，如松花粉多糖可有效抑制病毒的黏附，還能顯著降低免疫器官的病毒載量，改善免疫抑制，板藍(lán)根作用于病毒的黏附和復(fù)制過程，能在一定程度上減輕炎癥反應(yīng)，黃芪多糖，槐樹多糖和川明參多糖等均可以通過促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌，激活免疫通路、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能來發(fā)揮抗病毒作用[11]；冰香散在最低無毒濃度下即可表現(xiàn)出預(yù)防和直接抑制體外流感病毒復(fù)制的作用[12]。就目前研究來看，青蒿素對黃病毒科中BVDV和丙型肝炎病毒具有抗病毒效果，但有關(guān)抗病毒機(jī)制方面的研究鮮見報道。本研究擬采用分子對接的方法預(yù)測青蒿素與BVDV NS5B的相互作用，在初步預(yù)測的基礎(chǔ)上，應(yīng)用MDBK細(xì)胞確定青蒿素對BVDV體外復(fù)制的影響，為進(jìn)一步研究青蒿素的抗病毒活性及其抗病毒機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及毒株 MDBK(CCL-22)細(xì)胞和NADL株BVDV(CP型)均由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)牛病防治工程技術(shù)中心實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 青蒿素提取物購于成都曼斯特生物公司，純度>98%，藥品均配制成濃度為200 μmol/L的儲備液，4 ℃保存，使用時用無血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清均購于四季青試劑公司；CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR熒光定量RT-PCR試劑盒購于TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)構(gòu)預(yù)處理 青蒿素結(jié)構(gòu)(MOL007424)源自TCMSP數(shù)據(jù)庫(http:∥lsp.Nwuedu.cn/tcmsp.Php)，通過PyMOL軟件轉(zhuǎn)換成PDB結(jié)構(gòu)；BVDV-NS5B受體蛋白(PDBID：1S48)源自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http:∥www.Rcsb.org/pdb)，下載得到FASTA Sequence結(jié)構(gòu)，通過SWISS-MODEL進(jìn)行同源建模(https:∥swissmodel.expasy.org/)，獲得并下載該蛋白，轉(zhuǎn)換成PDB晶體結(jié)構(gòu)。模擬對接前蛋白分子和藥物小分子均通過Autodock Tools1.5.6進(jìn)行加氫、減電荷及非極性氫鍵結(jié)合處理，保存成PDBQT文件。

1.2.2 Autodock分子對接 將處理完畢的配體分子(青蒿素)和受體分子(BVDV-NS5B)用Autodock軟件進(jìn)行分子對接，設(shè)置格點間隔值。設(shè)置Grid參數(shù)，x為118，y為108，z為90，運(yùn)行程序進(jìn)行對接。用Autodock軟件分析生成對接的.dlg文件，根據(jù)結(jié)合能等情況選擇結(jié)合能最低的結(jié)合構(gòu)象并保存成.PDBQT文件。通過PyMOL軟件對其分子構(gòu)象進(jìn)行Cartoon展示并生成圖片。

1.2.3 青蒿素對細(xì)胞毒性的測定 采用CCK-8試劑盒對不同濃度青蒿素作用于MDBK細(xì)胞后的細(xì)胞毒性進(jìn)行測定。將生長狀態(tài)良好的MDBK細(xì)胞按照每孔100 μL(1×105/mL)接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞長到匯合度為80%時，棄掉營養(yǎng)液并用PBS洗滌3次。隨后，用DMEM培養(yǎng)液把青蒿素儲備液(200 μmol/L)稀釋為11個不同濃度：0(對照組)、2.5、5、10、20、40、60、80、100、150、200 μmol/L，每個濃度設(shè)4個重復(fù)孔，每孔加入100 μL藥物稀釋液，并設(shè)置4個空白對照孔(不加細(xì)胞和藥物，只有培養(yǎng)液)。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，培養(yǎng)2 h后，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度(D)值。

依據(jù)公式：細(xì)胞存活率(%)=(D450 nm藥物組-D450 nm空白對照組)/(D450 nm細(xì)胞對照組-D450 nm空白對照組)×100%，計算MDBK細(xì)胞在不同濃度下青蒿素的細(xì)胞存活率。

1.2.4 青蒿素體外抗BVDV活性試驗 MDBK細(xì)胞處理同1.2.3。根據(jù)青蒿素對MDBK細(xì)胞毒性的檢測結(jié)果，用細(xì)胞維持液以青蒿素最適濃度為基準(zhǔn)進(jìn)行2倍梯度稀釋，依次稀釋成5個濃度備用；各試驗組使用感染復(fù)數(shù)(MOI)為0.1的劑量接種BVDV病毒液，同時設(shè)置正常細(xì)胞對照組、病毒對照組(0 μmol/L青蒿素)、空白對照組，每組均做4個重復(fù)孔。根據(jù)藥物與病毒添加的先后順序探究藥物抑制作用、預(yù)防作用和殺滅作用。其中藥物抑制試驗是在各試驗組每孔先接種上述劑量的BVDV 2 h后棄去，再加入200 μL不同濃度的藥物；藥物預(yù)防試驗是在各試驗組每孔加入200 μL不同濃度的藥物作用4 h后棄去，再接種上述劑量的BVDV作用2 h后棄去，再在每孔加入200 μL不同濃度的藥物；藥物殺滅作用是在各試驗組每孔中同時添加不同濃度的藥物溶液與等體積病毒液的混合液200 μL，作用4 h后棄去，每孔再加入200 μL不同濃度的藥物。放置培養(yǎng)箱作用并逐日觀察病變，待出現(xiàn)明顯病變時向各孔中加入20 μL的CCK-8溶液，隨后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中作用2 h,用酶標(biāo)儀進(jìn)行細(xì)胞活性的檢測，按照1.2.3中方法計算各組的細(xì)胞存活率。

1.2.5 藥物對 BVDV復(fù)制的影響 確定了3種不同方式下青蒿素抗BVDV的最佳濃度后，按照藥物體外抑制BVDV、藥物體外預(yù)防BVDV和藥物體外殺滅BVDV 3種作用方式開展試驗，每孔加入MOI為0.1的BVDV病毒液，并設(shè)置病毒對照組。在48 h以及72 h時提取各組總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，作為模板，進(jìn)行SYBR Green 法熒光定量技術(shù)檢驗。BVDV引物序列為：F：5′-GAGT-ACAGGGTAGTCGTCAG-3′;R：5′-CTCTGCAG-CACCCTATCAGG-3′(引物為黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)牛病防治工程技術(shù)中心實驗室保存)。預(yù)期擴(kuò)增長度為130 bp。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出其病毒載量。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理。試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，P>0.05表示差異不顯著；P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 青蒿素與BVDV-NS5B對接分析結(jié)果

結(jié)果表明，通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫收集到的BVDV-NS5B受體蛋白(PDBID：1S48)存在潛在作用靶點，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫收集到青蒿素的配體結(jié)構(gòu)，進(jìn)行分子對接找到藥物與BVDV NS5B蛋白結(jié)合的“分子口袋”。經(jīng)過模擬篩選以及Autodock軟件進(jìn)行運(yùn)算分析，最終得到10個分子和對應(yīng)的打分(表1)。結(jié)果表明，青蒿素位點1與BVDV-NS5B結(jié)合后的結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定，結(jié)合自由能為-28.6748 kJ/mol。圖1為青蒿素位點1與BVDV-NS5B的結(jié)合圖，提示青蒿素可能具有抑制BVDV活性的功能。

表1 青蒿素與BVDV-NS5B不同對接位點的結(jié)合能

圖1 青蒿素與BVDV-NS5B結(jié)合圖

2.2 青蒿素對細(xì)胞的毒性試驗

由圖2可知，作用72 h后，與0 μmol/L青蒿素處理(對照組)相比，2.5、5、10、20、40、60、80 μmol/L青蒿素處理組MDBK細(xì)胞存活率均極顯著提高(P<0.01)，而100、150、200 μmol/L青蒿素處理后的細(xì)胞存活率與0 μmol/L 青蒿素處理后的存活率變化幅度相對較小。最大安全濃度應(yīng)選擇濃度低且對細(xì)胞活性影響較小的濃度，故選定100 μmol/L青蒿素為最大安全濃度。

與對照組相比，*，差異顯著(P<0.05);**,差異極顯著(P<0.01)。下同

2.3 青蒿素抗BVDV效果

2.3.1 青蒿素對BVDV的抑制作用 在上述試驗基礎(chǔ)上，將青蒿素依次稀釋為100、50、25、12.5、6.25 μmol/L進(jìn)行后續(xù)試驗。在先加病毒再加藥的給藥方式下，細(xì)胞觀察結(jié)果顯示，試驗組與病毒對照組相比，細(xì)胞病變的程度均有所減輕。由圖3A可知，青蒿素添加濃度為100、50、25、12.5 μmol/L時MDBK細(xì)胞存活率均在50%以上，且極顯著高于病毒對照組(P<0.01)，其中濃度為100 μmol/L時抑制作用最為顯著，細(xì)胞存活率高達(dá)71%，表明該作用方式下青蒿素對BVDV有較強(qiáng)抑制作用。

2.3.2 青蒿素對BVDV的預(yù)防作用 在先加藥再加病毒的給藥方式下，觀察發(fā)現(xiàn)，試驗組與病毒對照組相比，細(xì)胞病變的程度均有所減輕。由圖3B可知，與病毒對照組相比，5個濃度水平的青蒿素均能極顯著提高M(jìn)DBK細(xì)胞的存活率(P<0.01)，其中青蒿素濃度為100 μmol/L時，預(yù)防作用最為顯著，細(xì)胞存活率達(dá)到了68%。

2.3.3 青蒿素對BVDV的殺滅作用 由圖3C可知，在藥物與病毒同時作用的給藥方式下，各加藥組的細(xì)胞存活率較病毒對照組均極顯著提高(P<0.01)。5種不同濃度的青蒿素對BVDV均表現(xiàn)出有一定的殺滅作用，且在安全濃度范圍內(nèi)，呈一定的量效關(guān)系。相比青蒿素的其他濃度組，100 μmol/L濃度組MDBK細(xì)胞的存活率最高(58%)。

A，抑制作用；B，預(yù)防作用；C，殺滅作用

綜合3種作用方式，均在青蒿素濃度為100 μmol/L時抗BVDV效果最為顯著，所以青蒿素對BVDV的最佳作用濃度為100 μmol/L。

2.4 青蒿素對 BVDV 復(fù)制的影響

在3種作用方式檢測青蒿素作用于MDBK細(xì)胞后BVDV的復(fù)制水平，如圖4所示，當(dāng)先加病毒后加藥物時，同病毒對照組相比，48 h抑制組與72 h抑制組均可極顯著降低BVDV在細(xì)胞中的表達(dá)量(P<0.01)，同72 h抑制組相比，48 h抑制組的抑制作用更為顯著。先加藥物后加病毒時(預(yù)防作用)，與病毒對照組相比，48與72 h預(yù)防組均能極顯著降低病毒表達(dá)量(P<0.01)，其中72 h的藥物預(yù)防作用更為顯著。當(dāng)藥物與病毒1∶1同時加入時，同病毒對照組相比，48與72 h殺滅組均可極顯著減少病毒在細(xì)胞中的復(fù)制(P<0.01)，但同預(yù)防組與抑制組相比，對BVDV復(fù)制效果影響相對較小。綜合3種方式，后給藥物體外培養(yǎng)48 h時青蒿素對BVDV復(fù)制的抑制作用更明顯，可大幅度降低BVDV拷貝數(shù)。

1，病毒對照組；2，48 h；3，72 h

3 討 論

在臨床應(yīng)用中，對于病毒性疾病的治療藥物篩選一直存在技術(shù)瓶頸，抗病毒特效藥物缺乏且存在不良反應(yīng)，中草藥因其獨特的作用機(jī)制，不易產(chǎn)生耐藥性且毒副作用小而受到廣泛的關(guān)注。目前，牛病毒性腹瀉的防控仍然是全球養(yǎng)牛業(yè)的難題，臨床上亟需能有效抑制BVDV的藥物。在新藥研發(fā)過程中，應(yīng)用虛擬篩選可以富集活性化合物，降低篩選成本，提高藥物篩選的可行性，因此已成為新藥研發(fā)的重要方法。自20世紀(jì)70年代中期首次出現(xiàn)以來，分子對接已經(jīng)成為一種獨特的輔助藥物設(shè)計和發(fā)現(xiàn)的計算機(jī)工具[13]。據(jù)報道，青蒿素對于RNA病毒具有不同程度的抗病毒效果，對部分黃病毒有良好的抑制作用[9]，但是對于BVDV，目前鮮見相關(guān)研究報道，其中藥物的抗病毒機(jī)制也不夠明晰。本研究探索了青蒿素對黃病毒科中BVDV的抗病毒效果。分子對接結(jié)果顯示，青蒿素與BVDV-NS5B蛋白存在相互作用，青蒿素中的10個活性位點均可與BVDV NS5B有機(jī)結(jié)合，通過打分結(jié)果可找到小分子配體與生物靶標(biāo)大分子結(jié)合的最優(yōu)構(gòu)象，預(yù)測出2個分子之間最佳的結(jié)合模式，最后將最佳配體進(jìn)行實體藥物篩選，可能篩選出具有活性的先導(dǎo)化合物。青蒿素活性位點1與BVDV-NS5B結(jié)合時的自由能為-28.6748 kJ/mol，結(jié)合的自由能較低，推測構(gòu)象穩(wěn)定，與受體結(jié)合的親和力強(qiáng)，對蛋白質(zhì)受體可能具有抑制活性，需要進(jìn)一步驗證。

篩選藥物的方法主要有體外試驗和體內(nèi)試驗，中藥的成分極其復(fù)雜，干擾體內(nèi)試驗的因素較復(fù)雜，故很難深入清楚了解藥物作用的本質(zhì)以及導(dǎo)致各種變化的細(xì)節(jié)、規(guī)律，而體外試驗可以了解藥物的作用規(guī)律并分析細(xì)節(jié)，可重復(fù)性高。目前，CCK-8試劑盒是MTT比色法的升級替代品，比MTT更加穩(wěn)定，對細(xì)胞毒性極小，測試結(jié)果更加穩(wěn)定，更加敏感[14-15]。因此采用CCK-8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗和抗病毒藥效學(xué)試驗，可更客觀地評價藥物的抗病毒作用[15]。不同濃度的青蒿素處理MDBK細(xì)胞后均維持了較高的細(xì)胞存活率，說明青蒿素藥物本身對MDBK細(xì)胞無毒性，部分濃度甚至可以促進(jìn)細(xì)胞生長，但為了減少藥物對細(xì)胞生長率的影響以及節(jié)約成本，故選取對MDBK細(xì)胞影響較小且較低的濃度進(jìn)行后續(xù)試驗。青蒿素在體外對BVDV復(fù)制的影響結(jié)果表明，青蒿素對MDBK細(xì)胞的最大安全濃度為100 μmol/L，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)3種作用方式下青蒿素對BVDV均有抑制作用，研究采用SYBR Green 法熒光定量技術(shù)檢測了BVDV在細(xì)胞中的水平，結(jié)果提示3種作用方式中藥物抑制組效果最佳，對病毒復(fù)制有極顯著的抑制作用，推測其抗病毒的主要效應(yīng)可能是青蒿素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)抑制了BVDV的復(fù)制或直接殺滅游離的BVDV而發(fā)揮作用，其確切的作用機(jī)理有待進(jìn)一步的深入研究。

中國的傳統(tǒng)中醫(yī)藥有著很長的發(fā)展歷史，在抗病毒研究領(lǐng)域中已取得很大進(jìn)展[16]。已有研究發(fā)現(xiàn)，訶子提取物對1型艾滋病病毒 (HIV-1)具有抑制作用[17]，甘青烏頭提取物可抑制單純皰疹病毒Ⅱ型(HSV-2)病毒[18]，二萜生物堿可明顯抑制甲型H1N1流感病毒 (H1N1)[19]，紫堇屬成分具有抗病毒作用[20]。研究表明，中藥單體或復(fù)方可以通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫實現(xiàn)對BVDV的抑制[21]。然而，目前國內(nèi)對抗BVDV的中藥研究基本停留在細(xì)胞水平上。另外，由于中藥制劑成分繁多，藥理作用復(fù)雜，作用靶點眾多，抗病毒的分子機(jī)制仍難以明確[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)單一使用青蒿素具有抗BVDV復(fù)制的作用，若聯(lián)合用藥可能更好抑制BVDV的復(fù)制，但需要結(jié)合體內(nèi)試驗進(jìn)行綜合評價，中藥單體或復(fù)方抗BVDV的分子機(jī)制仍是需要解決的科學(xué)問題。

4 結(jié) 論

本研究利用分子對接技術(shù)初步確定了青蒿素與BVDV-NS5B的互作關(guān)系，并發(fā)現(xiàn)BVDV感染MDBK細(xì)胞后給予100 μmol/L的青蒿素作用48 h，其對BVDV復(fù)制的抑制作用最強(qiáng)，為抗BVDV藥物開發(fā)提供了新思路。