連花柴芩可溶性粉對雞風熱犯肺證的臨床試驗研究

王學方，歸 榮，陳功義，王 偉2,，張紅英，王學兵，李 曉

(1.河南農業大學動物醫學院,鄭州 450000；2.河南省納普生物技術有限公司，鄭州 450002；3.河南農業職業學院，鄭州 451450；4.河南省科學院，鄭州 450002)

呼吸系統疾病是畜禽養殖中的常見和多發類疾病，特別是在集約化養殖中，呼吸系統疾病已成為制約中國養殖業發展的一個重要因素。上呼吸道感染是畜禽生產實踐中最常見的呼吸系統疾病，控制上呼吸道感染及其并發、繼發感染已成為各個養殖群體疫病防控的重要目標。目前，對上呼吸道感染的治療，臨床上多以抗菌、抗病毒、解熱鎮痛等化學藥物治療為主，但不能獲得理想療效，且易造成抗生素濫用、藥物殘留，不利于長期治療[1]。中獸藥具有作用多靶點、低殘低毒、不易產生耐藥性等優點[2-4]，在治療上呼吸道感染方面有著較強的應用優勢。從中獸醫理論分析，禽上呼吸道感染辨證多為六淫或疫癘等病邪侵襲肺衛而造成的肺經外感疾病[5]。雞風熱犯肺證多見于上呼吸道感染初期，風溫病初起，正氣不足以御邪，風熱病邪乘虛侵入肺衛，以致衛氣被郁、肺失宣降所表現的證候。病機由外感風熱、肺氣壅阻、失于清肅所致，邪在肺衛，由于雞的生理特點，病邪易內郁、從陽化熱，可快速向內傳及到氣分受病，出現衛、氣同病或表里同病。病禽主證表現為縮頸乍毛、不愿走動、發熱、流涕、咳嗽、氣管啰音、張口呼吸、口渴、食欲降低等癥狀。據辨證論治體系的理、法、方、藥，對本證應疏散風熱，治熱防變，同時清肺止咳，截斷病勢傳變。

連花柴芩可溶性粉是由連翹、山銀花、柴胡、黃芩、紫蘇葉、甘草六味制成的中獸藥可溶性粉劑，連翹[6-8]、山銀花[9]為君藥，既辛涼解表、疏散表邪，還可清熱解毒、攻除里熱；柴胡[10]苦平、疏肝解郁、和解退熱、升舉陽氣，黃芩[11-12]苦寒，清熱燥濕，瀉火解毒，兩藥一升清一降濁，配伍使用，清解半表半里之邪，和解少陽、調暢樞機、使郁熱有外達之機為臣藥；紫蘇葉[13]祛風解表、行氣和胃，甘草[14]補脾益氣、祛痰止咳、調和諸藥共為佐使。全方合用，共清熱解毒、宣肺止咳之效。本試驗旨在研究連花柴芩可溶性粉對風熱犯肺所導致的雞發熱、咳嗽、食欲減退、口渴喜飲等證候的臨床療效并初步探討其機制，以期為中獸藥在風熱犯肺證的治療中提供科學數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)IBV-M41標準毒株購自中國獸醫藥品監察所，批號：AV1511，實驗室測定其雞胚半數感染量(EID50)為10-6.32/0.1 mL。

1.1.2 藥物 連花柴芩可溶性粉由河南中亞神鵬醫藥科技有限公司提供，批號：20190826；麻杏石甘顆粒購自河北瑞高動物藥業有限公司，批號：19100802；經河南省獸藥監察所檢驗均符合標準。

1.1.3 主要試劑 RPMI-1640培養基購自HyClone公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；10 kU/mL青霉素、10 mg/mL鏈霉素均購自北京雷根生物技術有限公司；L-谷氨酰胺購自WOLSEN公司；刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)均購自Sigma-Aldrich公司；淋巴細胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司；鼠抗雞CD3-FITC、CD4-PE和CD8a-PE、鼠抗人IgG1-FITC和IgG1-PE單克隆抗體均購自艾美捷科技有限公司。

1.1.4 試驗動物 1日齡AA白羽肉雞公雛購自河南省開封市興達禽業有限公司。常規飼養至15日齡供試驗用。試驗期間未做雞傳染性支氣管炎疫苗免疫。飼料購于河南省金諾飼料有限公司，為不含任何抗生素及其他抗病促生長藥物的雛雞全價飼料。

1.2 方法

1.2.1 雞風熱犯肺證模型的建立

1.2.1.1 IBV種毒復壯 IBV標準株M41在使用前用雞胚復壯。種毒用滅菌PBS液10倍稀釋，經尿囊腔接種于10日齡SPF雞胚，0.1 mL/胚，37 ℃培養72 h，收集雞胚尿囊液，加入青霉素1 000 IU/mL、鏈霉素1 mg/mL混勻，以3 000 r/min離心30 min，取上清液-40 ℃保存備用。以上述方法盲傳3代，試驗用毒種為IBV第3代病毒，EID50為10-6.32/0.1 mL。

1.2.1.2 攻毒量篩選 1日齡健康AA白羽肉雞公雛50只，飼養至15日齡，隨機分成5組，10只/組，取經雞胚盲傳3代進行復壯的IBV-M41病毒液進行10倍稀釋，分別以0、0.1、0.2、0.3、0.4 mL/羽的劑量對雛雞滴鼻點眼進行攻毒。攻毒前12 h，將雞舍室溫調至20 ℃，并室內噴淋冷水使相對濕度保持在70%以上。試驗組攻毒后自由飲水采食，試驗期間不接種任何疫苗。觀察攻毒后每組雞的臨床癥狀，確定建立雞風熱犯肺證模型的攻毒量。

1.2.1.3 診斷標準 根據《中獸醫學》[15]和《中獸醫基礎理論》[16]臟腑辨證中風熱犯肺證的診治原則，結合《中醫內科病證診斷療效標準》[17]、《中藥新藥臨床研究指導原則》[18]和《獸藥研究技術指導原則匯編》[19]中風熱犯肺證的診斷標準及雞的生理特征，風熱犯肺證主證為咳喘、發熱；次證包括口干咽痛、鼻塞流涕、食欲下降等，制定了本試驗雞風熱犯肺的診斷標準為：①精神沉郁、羽毛蓬亂、反應遲鈍；②發熱，體溫>41.5 ℃；③咳嗽、打噴嚏、甩頭、流涕、氣管啰音或張口呼吸；④食欲不振、飲水增加。

1.2.1.4 病例納入標準與排除標準 本試驗設置精神狀態、體溫、呼吸道3項指標對風熱犯肺主證，采用分別量化分級評分法，將病雞臨床癥狀分為無癥狀、癥狀輕、中、重，分別記0、1、2、3分。各項指標的積分權重方面，考慮到精神狀態人為判斷的主觀因素影響，積分權重應較低，設為10%；呼吸道癥狀權重比體溫權重稍高，二者分別設為50%和40%。最終積分評定按各指標積分權重，計算總積分。具體各指標對應積分情況見表1。

表1 各指標積分標準

納入標準：符合雞風熱犯肺證臨床試驗動物診斷標準(用藥前總積分≥1)。

排除標準：①不符合上述標準的發病雞；②雞群發病突然，且死亡率超過50%；③發熱至體表皮膚尤其是冠髯嚴重發紺；④伴輕中度以上腹瀉；⑤殘疾、受傷、弱小的雞。

1.2.2 動物分組與處理 臨床健康15日齡AA白羽肉雞，采用10倍稀釋的IBV-M41第3代雞胚尿囊液滴鼻點眼染毒，0.3 mL/只。于攻毒前12 h，將雞舍室溫調至20 ℃，并于室內噴淋冷水使相對濕度保持在70%以上。攻毒2 d后選擇符合風熱犯肺證納入標準的試驗雞150只，隨機均分為5組，30只/組，分別為：連花柴芩可溶性粉高、中、低劑量組(簡稱高、中、低劑量組，根據試驗前期用藥劑量的篩選結果，連花柴芩可溶性粉濃度分別設為4、2和1 g/L)、藥物對照組(麻杏石甘顆粒,1 g/L)、模型對照組，另設30只為健康對照組。健康對照組與其他各組分開飼養，各組飼養條件一致。連花柴芩可溶性粉高、中、低劑量組、藥物對照組采用飲水給藥方法，連續給藥5 d，每天給藥1次。模型對照組和健康對照組不用藥物，自由飲水和采食。

1.2.3 療效評價 結合主證與次證，綜合評價連花柴芩可溶性粉用于雞風熱犯肺所致的發熱、咳嗽、食欲下降、口渴喜飲的臨床效果。

1.2.3.1 主證指標與療效評價標準 ①精神狀況：觀察每只試驗雞的精神、羽毛狀態，按照積分標準記錄每只雞得分；②體溫：測量每只試驗雞給藥前及給藥1、2、3、4、5 d后的體溫，按照積分標準記錄每只雞得分；③呼吸道癥狀：觀察每只試驗雞給藥前及給藥5 d中的呼吸道癥狀，按照積分標準記錄每只雞得分，計算每組的呼吸道癥狀評分百分比；④療效評價標準：根據以上評分標準，評價每只存活雞給藥前后的積分情況，計算療效指數。療效判定標準以療效指數表示。臨床療效判定標準見表2。根據臨床療效判定標準統計治愈數、有效數和無效數。

呼吸道癥狀評分百分比(%)=每組癥狀評分總和/每組中最大可能的癥狀評分總和×100%

療效指數(%)=(治療前積分-治療后積分)/治療前積分×100%

1.2.3.2 采食、飲水等次證指標考察 由于雞采食、飲水量不易精確到個體，所以試驗期間通過記錄每組雞的采食飲水量，對風熱犯肺次證進行臨床療效評價。各試驗組雞，記錄每天飼料、飲水的給予量與剩余量，計算各試驗組雞的平均采食量、平均飲水量；分別在給藥前、給藥后第5天上午8:00到10：00逐只稱取每只存活雞體重，計算各組平均體重，計算體增重。

1.2.4 免疫指標

1.2.4.1 免疫器官指數 試驗各組于停藥后第5天，每組隨機抽取10只雞剖殺，稱重，摘取胸腺、法氏囊及脾臟并稱重，計算免疫器官指數。

免疫器官指數(mg/g)=試驗結束時的免疫器官重量(mg)/體重(g)

1.2.4.2 雞外周血T細胞亞群 各試驗組于用藥前、停藥后第1和5天，每組隨機取10只雞，翅下靜脈無菌采血，肝素抗凝后，將抗凝血樣與D-Hank’s液1∶1混勻進行稀釋，再取稀釋血樣沿試管壁緩慢加在同等體積淋巴細胞分離液上層，2 000 r/min離心20 min，分離淋巴細胞，用PBS將細胞數調至5×106/mL。一管加入鼠抗雞CD3-FITC、CD4-PE單克隆抗體各10 μL，另一管加入CD3-FITC、CD8a-PE單克隆抗體各10 μL，相應對照管加入鼠抗人IgG1-FITC、IgG1-PE單克隆抗體各10 μL，再分別加入淋巴細胞懸液50 μL，混勻，4 ℃避光作用20 min。加入PBS 500 μL，混勻，室溫避光作用10 min，1 500 r/min離心10 min，棄去上清，再加入PBS 500 μL，重懸細胞，流式細胞儀檢測，得出CD3+、CD4+、CD8+百分數。

1.3 數據統計分析

將各項指標進行數據統計，計數資料以χ2檢驗分析；計量資料采用SPSS 18.0軟件進行方差分析，差異顯著時進行Duncan’s多重比較。結果用平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 雞風熱犯肺證模型的建立

攻毒后，第1天雞開始出現精神沉郁、羽毛松亂現象，第2天出現咳嗽、打噴嚏、觸診發熱，夜間觀察能聽到明顯的濕性氣管啰音，嚴重者伸直頭頸，因呼吸困難而張口呼吸，雞群采食欲下降，飲水增加，攻毒后第7天剖檢病雞發現其氣管部有漿液、黏液性滲出物，氣管環出血，肺臟出血。

比較不同攻毒量發病情況，接種0.1～0.2 mL IBV-M41病毒液后雛雞發病率為80%以上；接種0.3 mL的雞群發病率為100%，呼吸道癥狀明顯；接種0.4 mL的雞群發病率為100%，表現出嚴重的呼吸道癥狀。故確定每羽接種0.3 mL經10倍稀釋的IBV-M41第3代雞胚尿囊液為本試驗的攻毒劑量。

試驗雞于攻毒2 d后臨床癥狀明顯，病雞主要表現為精神不振或萎靡，羽毛蓬亂，扎堆，翅膀下垂，閉目呆立，食欲下降，飲水欲增加，體溫升高，流涕，打噴嚏，咳嗽，夜間觀察能聽到明顯的氣管啰音，嚴重者伸直頭頸，張口呼吸，符合風熱犯肺證候表現。

2.2 療效評價

2.2.1 主證指標

2.2.1.1 各組雞體溫變化 由表3可知，在攻毒2 d后，除健康對照組外，各試驗組雞體溫均超過正常體溫，處于發熱狀態。在給藥后3 和5 d，連花柴芩可溶性粉高、中、低劑量組及藥物對照組體溫均顯著低于模型對照組(P<0.05)，但仍顯著高于健康對照組(P<0.05)，高、中劑量組體溫顯著低于藥物對照組(P<0.05)。

表3 各組雞體溫變化

2.2.1.2 各組雞呼吸道癥狀 攻毒1 d后雞群陸續發病，迅速波及全群，攻毒后第2～3天，各攻毒試驗組呼吸道癥狀程度到達高峰。

給藥后3 d，連花柴芩可溶性粉各試驗組和藥物對照組呼吸道癥狀呈減輕趨勢；用藥后5 d，連花柴芩可溶性粉各試驗組和藥物對照組呼吸道癥狀大幅好轉，高、中劑量組呼吸道癥狀程度較輕。用藥前后共6個時間點的呼吸道癥狀百分比見圖1。

圖1 各組雞呼吸道癥狀評分變化

2.2.1.3 主證臨床療效 依據療效判定標準，統計各試驗組的治愈數、有效數與無效數，計算治愈率、有效率及無效率(總有效率為治愈率和有效率之和)，結果見表4。比較各治療組的總有效率，以連花柴芩可溶性粉高、中劑量組較好，總有效率分別為90.00%和86.66%，顯著高于模型對照組(P<0.05)。連花柴芩可溶性粉高、中劑量的治愈率、有效率與總有效率均無顯著差異(P>0.05)。

表4 連花柴芩可溶性粉的臨床療效結果

2.2.2 次證指標

2.2.2.1 各組雞采食量 攻毒2 d后，除健康對照組外，各試驗組雞均出現采食量下降趨勢。給藥后3 d，連花柴芩可溶性粉高、中劑量組雞采食量與模型對照組相比顯著提高(P<0.05)，且高、中劑量雞采食量顯著高于藥物對照組(P<0.05)；給藥后5 d，連花柴芩可溶性粉高、中、低劑量組、藥物對照組雞采食量均顯著高于模型對照組(P<0.05)，其中高劑量組與健康對照組無顯著差異(P>0.05)(表5)。

表5 連花柴芩可溶性粉對雞平均采食量的影響

2.2.2.2 各組雞飲水量 給藥前，各試驗組雞飲水量無顯著差異(P>0.05)；給藥后3 d，除健康對照組外，各試驗組雞均出現飲水量增加的趨勢。給藥后5 d，連花柴芩可溶性粉高、中、低劑量組、藥物對照組雞飲水量與模型對照組相比差異顯著(P<0.05)，中劑量組雞飲水量與藥物對照組相比差異顯著(P<0.05)，高、中劑量組與健康對照組相比無顯著差異(P>0.05)(表6)。

表6 連花柴芩可溶性粉對雞平均飲水量的影響

2.2.2.3 各組雞體重 給藥前，除健康對照組外，由于采食量下降，各試驗組雞體重增長也受到影響。給藥后5 d，連花柴芩可溶性粉高、中、低劑量組、藥物對照組雞體重、體增重與模型對照組相比顯著提高(P<0.05)，且高、中劑量組雞體重、體增重顯著高于藥物對照組(P<0.05)，高劑量組雞體增重與健康對照組比無顯著差異(P>0.05)，連花柴芩可溶性粉高劑量組雞體重、體增重與中劑量組比無顯著差異(P>0.05)(表7)。

表7 連花柴芩可溶性粉對雞體重的影響

2.2.3 免疫指標

2.2.3.1 各組雞免疫器官指數 由表8可知，連花柴芩可溶性粉高、中劑量組雞的胸腺指數顯著高于健康對照組(P<0.05)，中劑量組雞的法氏囊指數顯著高于模型對照組和健康對照組(P<0.05)；各試驗雞的脾臟指數無顯著差異(P>0.05)。

表8 連花柴芩可溶性粉對雞免疫器官指數的影響

2.2.3.2 免疫細胞亞群的影響 給藥前，與健康對照組相比，各試驗組雞外周血CD3+、CD4+T淋巴細胞含量均顯著降低(P<0.05)；停藥后第1天，連花柴芩可溶性粉高、中、低劑量組、藥物對照組雞外周血CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞含量升高，均顯著高于模型對照組與健康對照組(P<0.05)，且高、中劑量組CD3+和CD4+T淋巴細胞含量顯著高于低劑量組與藥物對照組(P<0.05)；停藥后第5天，連花柴芩可溶性粉高、中劑量雞外周血CD3+、CD8+T淋巴細胞及低劑量組CD4+T細胞含量均顯著高于模型對照組與健康對照組(P<0.05)，且高、中劑量組CD4+T細胞含量顯著高于低劑量組與藥物對照組(P<0.05) (表9)。

表9 連花柴芩可溶性粉對雞CD3+、CD4+、CD8+ T細胞含量的影響

3 討 論

目前，關于雞風熱犯肺證模型建立的報道較少，鄧銳涵等[20]采用H9N2亞型禽流感病毒(AIV)與脂多糖(LPS)混合感染的方式人工建立雞風熱犯肺證模型并應用于金芩藍口服液的療效評價，其病例納入標準包括主癥:發熱、咳嗽、甩鼻、咽喉腫脹；次癥:眼睛變形結膜充血、腹瀉、精神沉郁、食欲減退、扎堆、口渴。與本試驗設立的主、次證基本一致，但本試驗在明確風熱犯肺主、次證的基礎上，進一步采用量化分級評分法制定了診斷標準和療效評價標準，以期能為風熱犯肺證中獸藥的療效評價提供參考。

中獸醫認為，新城疫病毒(Newcastledisease virus,NDV)、IBV、傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)、流感病毒等均為“疫氣”，皆屬“熱毒”范疇，在氣溫驟變、季節交替等環境下，風熱之毒侵犯肺衛，均易造成雞的風熱犯肺證。本試驗藥物的抗病毒作用是其用于雞風熱犯肺證的重要基礎。連花柴芩可溶性粉由六味中藥組成，分別為連翹、山銀花、柴胡、黃芩、紫蘇葉和甘草。本試驗前期設置連花柴芩可溶性粉0.25、0.5、1、2、4、8 g/L 6個不同給藥劑量，混飲給藥，進行臨床用藥劑量的篩選，結果表明連花柴芩可溶性粉給藥劑量為2.0 g/L時，臨床療效及用藥成本綜合較佳。因此，本試驗以此劑量為基礎，設置4、2和1 g/L高、中、低 3個劑量組進行連花柴芩可溶性粉的臨床試驗。大量研究表明，連翹、山銀花有直接抗流感病毒作用[21]，連翹水提液能抑制H5N1和H9N2亞型 AIV在DF-1細胞中的增殖，降低炎癥相關細胞因子CX3CL1、IL8L1、CCL5、IL-6和TNF-α的表達[22]，連翹中的主要成分連翹酯苷可顯著誘生人工感染IBV雛雞體內IFN-α的mRNA水平[23]，顯著抑制細胞內IBV的復制，提高IBV感染細胞內受體(MDA5、LGP2、NLRC5)和抗病毒基因(IRF7、IFN-α、IFN-β)mRNA的表達[24]，說明連翹有良好的抗炎、抗病毒和解熱作用。陳靈等[25]研究表明，山銀花水提物具有體外抗甲型H1N1病毒作用，且以治療給藥和直接殺滅給藥抗病毒作用較好，金銀花和山銀花綠原酸類提取物體外均具有顯著的抗NDV的作用[26]，這也是試驗藥物選擇連翹、山銀花作為主藥治療雞風熱犯肺證的重要基礎。此外，連翹酯苷可明顯降低副流感病毒感染后家兔的體溫[27]，金銀花對試驗性發熱具有明顯的解熱作用[28]，柴芩水提液對LPS誘導的發熱小鼠具有明顯的退熱作用[29]，這與本試驗藥物組方中將連翹、山銀花、黃芩和柴胡合用可顯著降低病雞體溫的結果一致。薛洋等[30]研究了黃芩苷防治雞傳染性支氣管炎的藥理作用，結果表明，黃芩苷可明顯提升病雞淋巴細胞轉化能力，顯著提高病雞CD3+、CD8+T淋巴細胞比率，且使IFN-α濃度長時間維持高水平。與本試驗就免疫器官指數和淋巴細胞增殖的結果相吻合。崔小七等[31]用柴黃顆粒防治雞傳染性支氣管效果較好，結果表明，在感染前7 d給予2 g/L柴黃顆粒對人工感染雞傳染性支氣管炎有較好的保護作用，使其發病率降至50%。本試驗結果表明，連花柴芩可溶性粉用于風熱犯肺證的臨床藥效可能與其調節機體免疫系統有關，這也提示有必要開展連花柴芩可溶性粉對雞風熱犯肺證的預防試驗，并在現有基礎上增加病雞預后病毒量、炎癥因子及相關蛋白等指標評價，對其實際臨床應用提供更全面、更科學的數據支撐。

4 結 論

本試驗采用IBV攻毒成功復制了雞風熱犯肺證模型，并進行了連花柴芩可溶性粉的臨床療效評價。結果表明，連花柴芩可溶性粉對風熱犯肺所致的雞發熱、咳嗽、食欲減退、口渴喜飲具有較好的緩解和治療效果，結合藥物量效關系和經濟成本等因素綜合考慮，推薦連花柴芩可溶性粉臨床應用劑量為2 g/L，飲水給藥，連用5 d。