蛋白的表達及相關性研究

李永樂,楊 恒,汪 淵,郝志強,王敬珅,錢 彪

(1.石河子大學，新疆 石河子 832000；2.東營市人民醫院，山東 東營 257000；3.聊城市第二人民醫院，山東 聊城 252000；4.贛南醫學院第一附屬醫院泌尿外科，江西 贛州 341000)

腎結石作為泌尿系統的常見病與多發病，嚴重影響人們的工作及生活，有流行病學研究顯示，泌尿系結石的患病率及發病率逐年遞增[1]，其中原因包括醫療診治技術的提高和人民生活水平及生活方式的改變，而且，晶體的聚集及生長誘導腎損傷病理形成和晶體物質對腎小管上皮細胞的刺激有直接的關聯，在有些晶體物質的刺激下，腎小管細胞對其做出氧化應激及炎性反應，更容易加速腎結石的形成與發展。近幾年發展過程中，很多研究表明腎結石患者發生代謝性疾病的可能性相應增加，即部分代謝性疾病的發生和結石有直接的關聯。機體的微炎性反應狀態、氧化應激激活的發生也會對腎結石的發生產生影響，腎臟疾病的發病率上升。腎小管上皮細胞在晶體物質的刺激作用下，會分泌一些物質，其中最主要的物質就是骨橋蛋白(OPN)。

相關研究發現，OPN是結石基質蛋白的主要成分，是一種存在于人體鈣化腎結石中的糖蛋白，OPN作為草酸鈣結石中含量最為豐富的蛋白之一，與腎結石的聚集形成有一定的相關性[2]。OPH可進一步誘導炎性細胞如單核-巨噬細胞遷移到病變部位，從而加重結晶部位的炎性反應，引起惡性循環。通過研究已知結晶的形成是一種生物礦化的過程，骨OPH參與這一過程并發揮重要作用。

OPN是草酸鈣結石基質的重要成分[3]，可能通過促進晶體黏附及介導氧化應激、細胞凋亡促進結石的形成[4]。對OPN與腎結石形成機制的研究，有助于為腎結石尋找新的預防及治療靶點，李征等研究[5]表明，血清OPN水平及尿液滲透壓升高可導致兒童腎結石的發生。OPN作為腎結石中的一種重要基質蛋白，其通過細胞內信號轉導途徑，促進草酸鈣晶體黏附于腎小管上皮[6]，且OPN的強陰離子活性，使其能容易與尿液中的Ca2+結合，成為草酸鈣晶體聚集的促進劑，導致鈣鹽沉積，誘發腎結石的形成[7]。

Igor Tamm和Frank Horsfall首先從正常人尿液中分離純化出一種能抑制病毒誘導血凝的黏液糖蛋白并命名為Tamm-Horsfall蛋白(THP)[8]，THP又稱為尿調節蛋白，是腎臟髓袢升支粗段和遠側曲管所合成并分泌的一種蛋白，經后續研究發現，這種蛋白不僅對T細胞增殖和單核細胞毒性具有體外免疫抑制的作用[8]，人們還推測出THP的其他生理作用，主要有參與介導鹽和水潴留、從而預防高血壓、預防腎結石形成、預防尿路感染以及可能在腎臟損傷中的作用。它自身的物理結構決定它在酸性介質中常以凝膠的形式存在，即尿液中透明管型的主要組成成分。

THP在尿中的排泄量較少，且受多種疾病的影響，如泌尿系梗阻、腎小管間質性腎炎、腎移植排斥反應等有著重要關系，當尿液及血清中檢測到高濃度的THP及抗THP抗體時常見于泌尿系梗阻及腎移植排斥反應[9]。THP可與中性粒細胞膜表面的整合素結合，導致腎小管間質細胞中炎性細胞聚集，這些炎性細胞產生的炎性反應因子和蛋白酶，可引起細胞組織損傷和細胞的吞噬作用[10-11]。當腎小管管腔內壓力增高或腎小管上皮細胞損傷時，分泌的THP經過破損的腎小管漏入腎小管管腔內，導致管腔內THP大量堆積，形成THP 管型，是造成腎功能衰竭的因素之一。酸性尿液、鈣離子、造影劑等都會造成THP的聚集[12]。上述研究表明 THP與腎小管損傷、炎性反應和鈣鹽晶體形成有著密切的聯系。也有體外試驗表明，高滲狀態、酸性條件(H+)和THP本身濃度的增加會促進THP的聚集，從而引起凝膠的形成，繼而就會形成透明的管型甚至腎結石。因此，THP不僅能促進草酸鈣晶體形成，且在某些病理條件下參與了尿石癥的發病機制[13]。

國內外均有研究表明，THP在代謝性疾病合并腎結石疾病中，有重要參考價值與意義。隋艷斐等研究[14]發現：糖尿病腎病中，可以將THP、α1-MG、β2-MG作為患者腎臟早期受損的重要指標。而在原發性高血壓合并腎結石的形成過程中，也有相關研究表明：THP為膀胱黏膜層中含量最多的且具有保護功能的尿糖蛋白，但是THP也是腎小管鑄型的主要成分，THP聚集已被認為是引起腎小管梗阻的急性腎功能衰竭發病機制的因素。本研究試圖通過納米細菌建立腎結石模型，動態觀察納米細菌腎結石的形成過程中OPN、THP的表達及與腎結石的相關性研究。

1 材料與方法

1.1材料：新疆醫科大學實驗動物中心SPF級Wistar雄性大鼠[合格證號：SCXK(新)2013-0001]，常規飼養6周后，篩選出90只體重約為(200±20) g的大鼠，基本飼料(石河子大學實驗動物中心)，10%中性福爾馬林(石河子大學醫學院病理科贈)，四環素(四川科倫藥業)，TG(Biofroxx)，電轉液、PBS(國藥化學試劑公司)，蛋白marker(10～250 kD)(海利克思)，PVDF膜(0.45 μm)、ECL底物液(美國羅氏公司)，兔多抗GAPDH(37 kD)、羊多抗OPN(25 kD)、兔多抗THP(121 kD)、HRP標記羊抗兔二抗、HRP標記兔抗羊二抗(Cell Signaling Technology)。

1.2方法：參考本課題組之前用納米細菌建立腎結石模型的方法建立模型后隨機分組：納米細菌組(NB組)：Wistar大鼠尾靜脈注射納米細菌懸液1.2 ml+2 ml生理鹽水灌胃；抗納米細菌組(NBT組)：Wistar大鼠尾靜脈注射納米細菌懸液1.2 ml+2 ml四環素溶液灌胃；對照組(NC組)：Wistar大鼠尾靜脈注射生理鹽水1.2 ml+2 ml生理鹽水灌胃，基本飼料標準化飼養1周后，每周每組隨機抽取3只大鼠，無菌采集腎臟標本后處死，共計10周。運用Western印跡檢測大鼠腎臟組織中OPN、THP的表達量并分析結果。本次研究經過本院醫學倫理委員會同意。

1.3統計學方法：采用SPSS23.0統計學軟件進行數據分析，用ImageJ測量目的條帶灰度值，相同時間段的組間比較用One-way ANOVA-LSD方差分析，相關分析采用Pearson相關系數表示。

2 結果

2.1各組大鼠腎臟組織中OPN表達量結果：試驗結果取各組大鼠腎臟，采用Western印跡檢測其OPN蛋白表達含量。以第8周為例，試驗結果較好，可見條帶清晰，內參穩定，X線片上，NB組、NBT組、NC組均可見清晰地黑色條帶，表明三組大鼠中均有OPN蛋白表達，但其表達量有所差別，NBT組OPN蛋白含量最高，NC組次之，NB組大鼠腎臟組織中OPN蛋白表達最低，對其進行統計學處理，結果顯示NB組、NBT組和NC組三組之間比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：與NC組比較，①P<0.05;與NBT組比較，②P<0.05圖1 三組大鼠腎臟組織中OPN蛋白表達對比

2.2各組大鼠腎臟組織中THP表達量結果:以第8周為例檢測三組大鼠腎臟THP蛋白的表達含量，X線片上，NB組條帶顏色較淺，NBT組、NC組均可見清晰地黑色條帶，由此可見三組大鼠中TH蛋白表達量有所不同，NB組大鼠腎臟組織中THP含量最低，NC組THP表達居中，NBT組大鼠腎小管上皮細胞THP分泌最多，統計學檢驗結果，NB組、NBT組和NC組三組之間比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：與NC組比較，①P<0.05;與NBT組比較，②P<0.05圖2 三組大鼠腎臟組織中THP蛋白表達對比

2.3OPN、THP相關性分析結果:對兩種蛋白利用Pearson相關性分析，結果顯示，所研究的兩種蛋白OPN與THP聯系緊密，增長趨勢具有一致性，二者極強相關(r=0.951，P<0.01)。見圖3。

圖3 OPN與THP的相關性分析

3 討論

腎結石是泌尿系統結石的主要組成部分之一，由于結石易復發、病情反復且并發癥多，已成為很多患者嚴重的負擔。目前腎結石的形成機制仍不清楚，既往觀點認為腎結石的形成過程包括尿液過飽和、晶體核心形成、晶體成長及聚集，然而目前越來越多的研究者強調腎小管上皮細胞與結石晶體間的相互影響[15]。有研究表明，聯合分析尿液中OPN與THP的含量，可作為腎結石早期診斷的標志物[16]，研究顯示，體外鈣刺激大鼠腎臟上皮細胞可誘導細胞OPN基因表達上調，OPN分泌增加[17]。而OPN的過度表達，能刺激機體分泌前列腺素，單核細胞趨化蛋白-1等一系列多種炎性因子，在局部產生氧化應激反應，從而誘發炎性反應，造成晶體的沉積與鈣化[18]。張杰[19]通過體外構建人腎小管上皮細胞結晶腎損傷模型證實LncRNA MALATI通過吸附miR-127-Sp調控OPN并影響細胞增殖及黏附活性進而參與草酸鈉結晶腎損傷的發生過程，能為晶體刺激腎臟細胞導致腎臟損傷提供有力證據，另一方面Yamate等[20]也證實在腎結石形成的早期階段，OPN具有促進草酸鈣結晶在細胞上沉積和黏附的作用，通過減低OPN表達可抑制草酸鈣晶體的沉積。因此，結石形成早期階段，OPN可能促進了NRK與草酸鈣結晶體的結合過程。

OPN作為腎結石的主要基質蛋白，一方面可促進晶體聚集、黏附、沉積，從而加速結石的形成，另一方面它的過度表達可誘發集體產生眾多炎性反應因子，引起腎臟慢性炎性反應，進一步造成晶體的沉積。腎臟慢性炎性反應的誘發，可引起腎臟功能的損傷，從而導致電解質代謝紊亂，進而誘發晶體的過飽和、沉積；大量晶體聚集和黏附，長期導致結石的形成，結石形成又會引起腎臟慢性炎性反應，如此循環，加快結石的形成和腎臟的損傷。

THP是人體尿液中的一種特異性陰離子蛋白，主要由腎小管上皮細胞分泌，混合于尿液中作為代謝廢物經尿道排出體外[21]。有報道稱，THP蛋白是草酸鈣晶體形成的抑制劑，是預防腎結石和腎集合系統感染的首道防線[22]。尿液THP、NGAL、血清Cys C與β2-MG可作為CKD患者早期評價GFR的敏感指標，聯合NGAL、THP作聯合預測因子可提高早期診斷腎損害的靈敏度及特異性，對于早期發現CKD患者腎小管損傷并評估其損害程度有重要的臨床意義[23]。所以THP可以在腎臟早期損傷中作為重要觀察指標，正常生理情況下，THP蛋白可對腎小管上皮細胞起到保護作用，其強烈的抗氧化作用，可有效減少氧自由基和過氧化物的產生，削弱腎臟組織局部氧化應激反應，減輕腎小管上皮細胞的損傷，降低結石的形成，而在腎結石患者尿液中，這種抑制作用卻很弱，難以起到防治腎結石形成的作用[24]。

OPN與THP兩種蛋白均與腎結石的發生發展有密切關系，研究表明，通過結合分析尿液中OPN與THP的含量，可作為腎結石早期診斷的標志物，且特異性高、敏感度好[16]。

綜上所述，OPN與THP均參與腎結石的形成與發展，且在腎結石患者中都有較高表達，OPN通過加速晶體黏附及聚集并參與體內氧化應激、誘發慢性炎性反應，從而引起腎結石的形成與發展；THP作為腎臟分泌的糖蛋白，生理條件下可參與體內水鹽，預防高血壓、腎結石的形成等，但在某些病理條件下大量THP產生、潴留可引起腎臟管型析出，進而引起腎結石的形成。本研究結果顯示OPN、THP蛋白在三組大鼠中均有表達，因為OPN、THP蛋白作為尿液中正常的成分而存在，因此即使對照組無誘石因素的存在，依然可以檢測到一定表達，但是三組表達量卻差異明顯，其中NBT組大鼠腎臟組織中表達最高，NB組含量最低，可能是因為四環素的抗菌作用，大鼠機體自身反饋調節，抑石物質表達增加，而NB組由于納米細菌對大鼠腎臟組織的損害，使OPN、THP表達減少，腎臟組織局部炎性反應明顯。

根據Pearson系數等級劃分，相關系數在0.8～1.0之間為極強相關，在0.6～0.8之間為強相關，代表腎臟局部炎性反應程度的兩種蛋白OPN與THP聯系緊密，增長趨勢具有一致性，二者極強相關(r=0.951，P<0.01)。

綜上所述，OPN、THP兩種大分子蛋白屬于尿液中的正常成分，二者作為抑石物質而發揮其功能。尿液中OPN的作用是通過抑制草酸鈣結晶的聚集、減小結晶體積、降低晶體黏附性等方面，從而有效抑制結石的形成。THP則通過抑制鈣鹽成核生長、競爭性與鈣離子結合等方式抑制結石形成。納米細菌對大鼠腎臟的影響可能是：使腎臟抑石成分分泌不足，達不到抑制結石形成的有效濃度，因此NB組大鼠腎臟組織中OPN、THP含量較低，由此可見體內抑石物質的缺乏是腎結石的主要形成原因之一。

OPN和THP在尿液中的早期可檢測性可以在早期腎結石患者的形成所致腎損傷提供參考依據，OPN和THP的實時檢測可為人們在預防腎結石的形成與發展中起到重要作用，這也將為如何利用OPN和THP防治腎結石及腎臟慢性損傷提供新的思路。