低表達NIPBL抑制骨髓間充質干細胞成骨并促進β連環蛋白磷酸化

劉 輝，張惠榮，馬雯晴，董麗麗，楊眷娣

(1.石河子大學醫學院，新疆 石河子 832000；2.石河子大學第一附屬醫院兒科，新疆 石河子 832000)

德朗熱綜合征(CDLS)是一種累及多系統的罕見病，具有顯著遺傳異質性，臨床表現輕重不一[1]，典型病例有特殊面容、嚴重生長遲滯及肢體畸形等特點。目前發現[2]，至少有7 個基因(NIPBL基因、錨蛋白重復域11基因、SMC3 基因、RAD21 基因、SMC1A 基因、溴結構域蛋白4基因、組蛋白去乙酰化酶8基因和)與 CDLS相關，其中最常見的為NIPBL基因，起到調控黏連蛋白的作用[3]。許多組織均有NIPBL的表達，其中在顱骨、前肢、鰓弓中表達最豐富，這與其出生后主要骨骼畸形高度一致[4]。有研究證實，CDLS患兒中骨骼畸形最主要的原因是NIPBL基因沉默[5]。

骨髓間充質干細胞是常見的“種子細胞”，是成骨前體細胞的主要來源，在一定的誘導條件下可以分化為成骨細胞[6]。前期課題組已成功驗證NIPBL基因突變小鼠肢芽中成骨標志蛋白下調[7]，然而在成骨分化過程受到多種因子及信號通路的影響[8]，其中Wnt/β-catenin信號通路在成骨過程中發揮重要作用[9]。本研究主要探討NIPBL沉默的小鼠骨髓間充質干細胞在成骨誘導后Wnt/β-catenin信號通路中的p-β-catenin蛋白、β-catenin 蛋白以及Lrp-5 mRNA的表達情況，從NIPBL基因調控骨骼生長發育的角度揭示CdLS的發病機制，為臨床CDLS的治療和干預提供新的思路。

1 材料和方法

1.1材料和儀器：小鼠骨髓間充質干細胞細胞株采購自中國科學院上海細胞庫。主要儀器和試劑：DMEM培養基(低糖)、0.25%胰蛋白消化酶(Gibco/BRL)、胎牛血清(Hyclone公司)；TrizolTM (Invitrogen公司)；Rt-PCR相關試劑采購于賽默飛公司；慢病毒(上海吉瑪公司)；成骨誘導液、茜素紅染料(美國Sigma公司)；β-catenin及磷酸化β-catenin單克隆抗體、HRP標記山羊抗兔IgG二抗(美國Abcam公司)；上海生工設計合成所有引物；二氧化碳培養箱(美國Thermo公司)；倒置相差顯微鏡(日本Nicon公司)；紫外分光光度計(美國Thermo公司)；羅氏LightCycler96實時熒光PCR儀器。

1.2方法

1.2.1細胞培養：用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養BMSCs，并置于5%CO2的37℃細胞培養箱，按1∶2進行傳代，當細胞密度達70%～80%時。

1.2.2細胞轉染：轉染前12 h，將骨髓間充質干細胞(15×104個/孔)接種于6孔板中。用攜帶shRNA-NIPBL-/+、空載體慢病毒轉染BMSCs，細胞中加入慢病毒(體積=感染復數×細胞數/慢病毒滴度)和5 μg/ml(polybrene)聚凝胺。培養12 h后用新鮮培養基換液。感染3 d后，用含2 μg/ml嘌呤霉素的新鮮培養基進行穩轉細胞的篩選。接下來，每2天更換一次含有嘌呤霉素的培養基，直到對照細胞完全死亡。用綠色熒光蛋白(GFP)作為檢測感染效率的標志物。在熒光顯微鏡下觀察直到GFP表達的病毒轉染效率達到85%以上，并擴大培養用于后續實驗。

1.2.3實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測BMSCs的NIPBL mRNA水平：首先建立分組，即空白組、空載體組、NIPBL沉默組，用Trizol試劑從骨髓間充質干細胞中提取總RNA，按照說明書逆轉錄合成cDNA。參數設置如下：42℃，60 min，70℃，5 min，4℃。此外，使用特異引物將cDNA用作擴增模板。見表1。根據制造商的說明，使用羅氏LightCycler96實時熒光PCR儀進行qRT-PCR。實驗參數為：95℃保溫2 min，95℃ 5 s，60℃ 20 s，循環30次，熔解階段。用2-ΔΔCt法計算NIPBL mRNA的相對表達水平，以β-actin作為對照。

表1 RT-qPCR 引物序列

1.2.4成骨誘導：胰酶消化三組骨髓間充質干細胞，將細胞接種于6孔板并調整細胞密度為10×104/cm2繼續培養，當密度達60%時用改用成骨誘導培養液培養，每間隔3 d全量換液，分別在第7天、第21天觀察細胞形態。

1.2.5茜素紅染色：成骨誘導第21天，移液器轉移走6孔板中的成骨誘導液，并用PBS清洗3次，多聚甲醛2 ml固定細胞30 min后用PBS再次清洗3次，茜素紅按1 ml/孔緩慢加入，靜置30 min后吸去茜素紅染料，PBS沖洗3次，顯微鏡下觀察鈣結節形成情況。

1.2.6qRT-PCR檢測成骨誘導后Lrp-5 mRNA的表達：用Trizol試劑提取三組骨髓間充質干細胞總RNA，按照說明書逆轉錄合成cDNA。參數設置如下：42℃，60 min，70℃，5 min，4℃。此外，使用特異引物將cDNA用作擴增模板(表1)。根據制造商的說明，使用羅氏LightCycler96實時熒光PCR儀進行qRT-PCR。實驗參數為：95℃保溫2 min，95℃ 5 s，60℃ 20 s循環30 s，循環40次，熔解階段。用2-ΔΔCt法計算Lrp-5 mRNA相對表達水平，以β-actin作為對照。

1.2.7Western印跡檢測β-catenin蛋白的表達：將空白組、空載體組、NIPBL沉默組分別在相同條件下成骨誘導21 d，用RIPA裂解緩沖液提取三組細胞的總蛋白，總蛋白濃度用BCA法進行測定，使三組蛋白濃度一致。經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉至聚偏氟乙烯膜，用5%脫脂牛奶封閉的PVDF膜在5%BSA中室溫孵育2 h，Tris-HCl緩沖鹽+Tween(TBST)洗滌液漂洗4次。加入一抗，4℃孵育過夜，再漂洗4次，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗體，室溫孵育2 h，漂洗4次。用化學發光檢測底物電化學發光(ECL)工作液顯色，采用Image J圖像分析系統對蛋白顯影圖進行灰度值分析，以GAPDH為內參，分析并比較三組β-catenin蛋白、p-β-catenin蛋白相對表達水平。

1.3統計學分析：使用Graphpad Prism9.0進行統計學分析，若各組間計量資料方差齊性且服從正態分布，采用單因素方差分析；若不服從正態分布或方差不齊，則選用秩和檢驗，P<0.05代表差異有統計學意義。

2 結果

2.1NIPBL基因沉默的骨髓間充質干細胞模型的建立及驗證：分別用陰性空載體、NIPBL+/-慢病毒轉染骨髓間充質干細胞，嘌呤霉素篩選后在熒光顯微鏡下觀察轉染效率。見圖1。

注：a：空載體陰性慢病毒(GFP-BMSCs)轉染BMSCs；b：NIPBL沉默組慢病毒(NIPBL-BMSCs)轉染BMSCs圖1 陰性空載體、NIPBL+/-慢病毒轉染BMSCs

qRT-PCR驗證NIPBL低表達，結果表明，BMSCs空白對照組和慢病毒陰性對照組NIPBL mRNA的表達量相當，兩者差異無統計學意義(P>0.05)。沉默組NIPBL mRNA的表達與BMSCs空白對照組和慢病毒陰性對照組相比顯著降低，差異有統計學意義(P<0.001)。見圖2。

注：①P<0.001圖2 RT-PCR檢測BMSCs NIPBL mRNA水平

2.2三組小鼠骨髓間充質干細胞成骨誘導過程中形態學變化及誘導21 d鈣顆粒的比較：三組細胞成骨誘導7 d時細胞逐漸變為不規則形，層次增加，貼合緊密，可見少量細胞結節；成骨誘導第21天三組細胞形態呈逐漸趨于圓形，有“鵝卵石” 樣改變，但NIPBL沉默組細胞顆粒量較低；茜素紅染色后顯微鏡下觀察發現NIPBL沉默組的鈣結節數量明顯低于空白組、陰性組。見圖3。

注：a空白組成骨誘導7 d、21 d及茜素紅染色；b空載體組成骨誘導7 d、21 d及茜素紅染色；c NIPBL沉默組成骨誘導7 d、21 d及茜素紅染色圖3 空白組、空載體組及NIPBL沉默組成骨誘導過程中細胞形態變化及茜素紅染色

2.3沉默NIPBL基因可促進骨髓間充質干細胞β-catenin蛋白的磷酸化：NIPBL沉默組與空載體組、空白組比較，NIPBL沉默使磷酸化β-catenin水平顯著升高(P<0.001)。但β-catenin總蛋白表達量顯著下降，差異有統計學意義(P<0.001)。見圖4。

注：①P<0.001圖4 三組骨髓間充質干細胞成骨誘導21 d時β-catenin、p-β-catenin蛋白的表達

2.4Wnt/β-catenin通路因子Lrp-5在三組間的表達情況：空白組和空載體組Lrp-5 mRNA的表達量相當，差異無統計學意義(P>0.05)。NIPBL沉默組的mRNA的表達與BMSCs空白對照組和慢病毒陰性對照組相比顯著降低，差異有統計學意義(P<0.001)。見圖5。

注：①P<0.001圖5 RT-PCR檢測骨髓間充質干細胞成骨誘導21 d時 Lrp-5 mRNA水平

3 討論

CDLS是一種累及多系統尤以骨骼發育障礙最為顯著的遺傳性疾病并且影響兒童性格形成及心理健康發展，常表現為注意力缺陷、焦慮、自閉等[10]。CDLS在胎兒期間就開始發病[11]，新生兒CDLS的患病率為1∶10 000～30 000，但這很可能是低估了，因為較輕的病例可能無法識別[12]，因此對疾病的治療往往出現滯后，而且需要長期多學科聯合協作治療，這將明顯增加家庭的經濟負擔。

NIPBL突變是導致CDLS發病最為重要的機制，它通過影響Cohesin復合物在DNA上的附著和脫落，Cohesin復合物與染色質相互作用來維持染色體以及蛋白復合物的穩定結構，從而介導姐妹染色單體聚集和細胞遠距離染色質相互作用，最終影響基因組修復和基因表達[13-15]。Maninder Kaur等[16]應用微滴式數字PCR技術發現與輕度患者和對照組相比，重度CDLS患者的NIPBL的表達水平較低，并且突變類型較嚴重患者的NIPBL水平也同樣較低。前期本課題組已證實NIPBL+/-小鼠胚胎時期(E17.5 d～E18.5 d)要比野生型同胞小鼠身長縮短 18%～19%，但它們的胎盤尺寸大小無明顯差異；同時，通過測量小鼠長骨及指骨發現骨長度縮短，而且有不同程度的骨化滯后。在剔除NIPBL 基因的小鼠胚胎的肢芽內軟骨細胞區域被嚴重破壞，這均說明小鼠骨骼發育異常主要是由于NIPBL 突變導致[17]。本研究則進一步從細胞層面證實了NIPBL沉默的骨髓間充質干細胞的成骨分化能力明顯降低，與成體形態學的研究結論一致。

Wnt通路通過調節細胞增殖、分化以及維持成體干細胞多能狀態，參與動物發育和維持組織內穩態平衡[18]，其中調節干細胞成骨分化是最為重要的作用之一[19]。β-catenin是Wnt/β-catenin通路的重要信號轉導分子，通過進入細胞核內來調節基因轉錄，從而使各種靶激活因子表達，如果沒有信號的刺激，β-catenin則通過磷酸化方式被降解[20]。本實驗發現，NIPBL沉默會降低β-catenin蛋白的表達，增加β-catenin蛋白的磷酸化水平。同時Wnt/β-catenin通路的共受體Lrp-5 mRNA的表達量也下降。

綜上，NIPBL沉默使β-catenin蛋白水平降低，但是β-catenin磷酸化蛋白的積累和總蛋白的降低只能間接表明β-catenin被抑制，本研究缺少NIPBL沉默而使β-catenin核轉位的直接證據，β-catenin必須通過核轉位來調控下游信號，從而發揮作用[21]。同時，Wnt/β-catenin通路的共受體Lrp-5 表達也有明顯下降，因此本實驗只能說明沉默NIPBL介導Wnt/β-catenin通路降低β-catenin的穩定性來抑制成骨形成。從NIPBL基因沉默導致骨骼發育異常為切入點，為德朗熱綜合征找到可能的治療靶點，進而為CDLS骨骼發育異常的預防、治療提供新的理論依據。