核仁磷酸蛋白在原發性肝癌中的表達水平及臨床意義

周 君，侯佳影，王麗萍，于文清，周 雪，劉清華

(1.石河子大學醫學院第一附屬醫院腫瘤內科，新疆 石河子 832008；2.新疆醫科大學第一附屬醫院昌吉分院，新疆 昌吉 831100；3.重慶市綦江區人民醫院感染科，重慶 401420；4.德陽市人民醫院腫瘤科，四川 德陽 618000)

原發性肝癌(PHC)在我國乃至全世界都具有極高發病率和致死率，發病率達4.7%，在世界范圍內的惡性腫瘤中居于第六，在癌癥致死率方面，排名第三，僅在肺癌與結直腸癌之下[1]。在世界新增男性肝癌人員中，我國占據了1/2左右，同時肝癌位于男性癌癥死亡譜第二位[2]。因此肝癌疾病負擔長期居高不下，在我國西部和農村地區尤其突出[3]。肝癌常隱匿發病，多數病例在進展為中晚期才被發現，顯著增大了早期診斷與干預治療肝癌的難度。肝癌診斷主要通過影像學、病理學以及基因測序、血清腫瘤標志物檢測等手段，因早期病灶較小，影像學敏感度較差，同時病理學檢測的創傷性，常不作為疾病診斷的首選。因此，對于無法接受病理學檢查的人員，血清腫瘤標志物測定可起到關鍵性的補充作用，經由此項檢查，或與其他類型診斷結果聯合判斷，實現早期發現肝臟腫瘤病灶。核仁磷酸蛋白(NPM)屬于核磷蛋白家族，NPM1是NPM家族中研究最為廣泛的成員，與其同屬于一個家族的蛋白還包括NPM2和NPM3。細胞中NPM的生物學功能較為復雜，涉及參與核糖體的合成，與中心體復制緊密相關，通過調控蛋白周期發揮分子伴侶功能，同時利用對目標基因的轉錄調節影響細胞增殖和凋亡[4]。研究發現它在增殖細胞中比在靜止細胞中表達水平顯著提高[5]。目前國內外多篇文獻報道NPM在惡性血液系統疾病、肺腺癌、宮頸鱗癌、膀胱癌及口腔鱗狀細胞癌[6-8]等多種腫瘤性疾病中高表達，且NPM表達上調大多正向相關于腫瘤的形成、遷移與侵襲。另有文獻提示NPM在部分乳腺癌[9]及胃癌組織中[10]表達低于相關癌旁及正常組織，此結果表明，在胃癌(GC)、乳腺癌(BC)內NPM對腫瘤可能起著抑制效應。2015年Ahuja R等發現，在慢性乙型病毒性肝炎(乙肝，CHB)中NPM可介導HBx(乙肝病毒x蛋白)發揮致癌效應，NPM升高常與預后不良存在關聯[11]。楊瓊等認為，NPM會提高肝纖維化速度，通過使NPM沉默表達和對其進行敲除途徑，能夠下調相關肝纖維化標志基因，如基質金屬蛋白酶9(MMP9)、Collagen Ⅰ與ACTA2等[12]。本研究通過酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測NPM在健康體檢者、CHB、肝炎后肝硬化(LC)及乙肝相關性原發性肝癌(PHC)患者血液和尿液中的表達水平，以期對診斷原發性肝癌提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取2020年10月～2021年5月本院相關科室就診的體檢健康者(HE)、CHB、肝炎后LC及乙肝相關性PHC患者295例。男156例(53%)，女139例(47%)，年齡(52.82±12.49)歲。67例HE為對照組，65例CHB患者、76例LC患者、87例乙肝相關性PHC患者為試驗組。在年齡上，比較慢性乙肝組、LC組未見明顯區別，其余組別皆顯示明顯區別(P<0.05)。見表1。試驗獲得本院醫學倫理委員會準可，受試者在試驗前均被詳細告知相關注意事項并由本人及家屬簽署知情同意書。

表1 研究對象基本信息

1.2納入標準及排除標準

1.2.1納入標準：①CHB患者、LC患者需與我國《慢性乙型肝炎防治指南》(2015版)[13]所示診斷條件相符；②乙肝相關性PHC病例符合我國2017年《原發性肝癌診療規范》[14]診斷要求；③在Child-pugh分級中，肝功能屬于A級、B級；④各組病例自愿參加本臨床研究，在本院存有完整臨床資料。

1.2.2排除標準：①其他類型病毒性肝炎(不含乙肝)及其所致的肝硬化、肝癌；②合并其他類型惡性腫瘤；③繼發性肝癌；④在Child-pugh分級中，肝功能屬于C級與/或大量腹水的存在；⑤合并泌尿系炎性疾病或其他慢性基礎疾病；⑥參與度差，漏脫風險高的患者。

1.3方法：所有入組對象于標本采取前1天22∶00后禁食，次日晨抽取外周靜脈血5 ml置于EDTA采血管中(紫頭管)，同時收集清晨中段尿標本5 ml置于尿管，靜置后使用離心機(鑫奧GENIUS 4K)以4 000 r/min離心10 min，二者上清液均分裝于無酶EP管后冰箱凍存備用。采購泉州市九邦生物科技有限公司的NPM通過ELISA檢測試劑盒檢測血、尿樣本，具體操作嚴格遵照實驗說明書進行。采用美國Bio-Tek(博騰)ELx800多功能酶標儀進行吸光度檢測。利用實驗所獲OD值建立坐標系繪制標準曲線以推算血清、尿標本NPM含量。

2 結果

2.1血液常規、生化功能、凝血功能分析表：收集HE、CHB、LC、PHC病例的相關臨床資料，統計分析提示各組紅細胞(RBC)、白細胞(WBC)、血小板(PLT)、清蛋白(ALB)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)及凝血酶原活動度(PTA)、凝血酶原時間(PT)、INR比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。四組肌酐值(Cr)比較，差異無統計學意義(皆P>0.05)。見表2。

表2 血常規、生化、血凝指標表達情況[P50(P25，P75)]

2.2血清、尿液NPM表達水平：血清NPM在HE中表達明顯低于CHB組、LC組及PHC組，差異有統計學意義(P<0.001)；LC組、PHC組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；尿液NPM在試驗組與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3，圖1。

表3 血液、尿液NPM在原發性肝癌不同病理階段表達水平[P50(P25，P75)，ng/ml]

注：與HE組比較，①P<0.001

2.3血清NPM對PHC的診斷效能：血清NPM對乙肝、肝硬化、肝癌均有一定診斷價值，當約登指數最大為0.34時，可檢出在診斷肝癌上，實現50.0%的敏感度，與84.0%的特異度，AUC=0.682。見表4，圖2。

表4 血清NPM診斷原發性肝癌的效能(ng/ml)

圖2 各指標單一與結合診斷PHC的ROC曲線

2.4血清甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、糖類抗原199(CA199)、NPM對PHC的診斷價值：統計分析四組對象的一般臨床資料(血清AFP、CEA、CA199)，將其與血清NPM相結合進行肝癌聯合診斷，描繪ROC曲線下面積。由表可知：與血清CEA、AFP、CA199聯合測定能夠促進肝癌診斷的靈敏度提升。見表5，圖2。

表5 血清NPM與AFP、CEA、CA199對原發性肝癌的診斷價值比較

2.5NPM在AFP陰性PHC中的診斷價值：臨床實踐中，觀察到一些PHC患者血清AFP表達低于預期診斷水平，從而降低的肝癌患者檢出率。本研究所收集的肝癌組中部分患者表現AFP陰性，統計處理這些患者的血清NPM表達量，并繪制ROC曲線，在確定約登指數最大為0.403時，AUC等于0.713 9，另特異度、靈敏度各是67.6%、72.7%。結果表明NPM對血清AFP陰性PHC患者也有一定的診斷價值。見圖3。

圖3 血清NPM診斷AFP陰性原發性肝癌的ROC曲線

3 討論

NPM的快速穿梭功能使其參與到許多細胞生物學過程中[15]。此外，NPM染色體變異可影響細胞生長發育[4]。目前多篇文獻報道NPM與惡性腫瘤發生發展存在密切關系，可用于腫瘤的早期診斷。現有文獻里關于血液中NPM的報道以血液系統疾病居多，暫未檢索到尿液中NPM研究的報道。

本試驗通過ELISA法檢查試驗組與對照組血清、尿液NPM表達水平，探究其在原發性肝癌中的表達規律及臨床意義。本研究血清NPM檢測結果與任鵬飛等提出的血清NPM單項對肝癌的診斷價值AUC可達0.713 9的結論相符[16]。

NPM在各組尿液檢測中表達無顯著差異。查閱國內外相關文獻目前尚無關于NPM在尿液中的報道。周金煦等檢測血液、膽汁及尿液中AFP表達水平時發現，尿檢中APF含量常與肝癌瘤體大小、腫瘤分期以及血液AFP表達呈正相關，且通常僅占血液的0.3%[17]。丁俊峰發現尿液中核基質蛋白22(NMP-22)含量在膀胱癌術后降低約2.3倍[18]。考慮腫瘤動態生長過程中細胞核內物質活躍，引起表達增高，在根治或減瘤術后表達驟降。由于本次研究所選取試驗病例偏少，未對原發性肝癌患者進行具體臨床分期及治療方式篩查，不除外為統計誤差所致，后續可經由提高樣本量途徑實施再次驗證，以探究原發性肝癌中尿液NPM的表達情況。

NPM在乙肝、肝硬化、肝癌患者血液中表達出現呈遞增狀態，云徑平等在觀察鼠肝切除術中發現NPM在肝臟再生過程中呈拋物線式表達，肝臟作為重要代謝器官其再生及修復能力極強[19]。乙肝病毒不斷復制推進病情進展過程中，肝細胞長期處于壞死與修復相互交替的狀態，NPM高表達可能在乙型病毒性肝炎病程發展中存在提示意義，可作為肝再生過程中評價肝細胞增生程度的標記物。

由于肝炎后肝硬化是慢性乙型病毒性肝炎向原發性肝癌進展轉化的必由病理階段，血清NPM在診斷PHC方面可能起著關鍵性作用。Liu M團隊發現NPM1抗體多出現于肝癌早期，檢測其陽性率可達22.4%[20]。王科妍等對PHC進行分期研究時發現，NPM等指標在肝硬化組中略高于TNM-Ⅰ期肝癌組，TNM-Ⅰ期肝癌組高于其他分期肝癌組，且均高于健康對照組[21]。既往通過收集研究PHC患者確診前12個月、9個月、6個月、3個月的血清發現越接近肝癌診斷時間點NPM陽性率越高[22]。楊瓊提出NPM、ACTA2和p-AKT/p-mTOR蛋白質在由TGF-β、LX-2細胞激活的肝星狀細胞中高表達，對NPM基因行沉默表達或敲除處理，可使MMP9、ACTA2與Collagen Ⅰ這三類肝纖維化標志基因表達下調，NPM此調控功能的達成可能離不開Akt途徑[12]。李祺福等等在對SMMC-7721的研究中發現NPM與c-Fos、c-Myc、mtP53、Rb等基因共同定位在細胞核基質上及細胞中，研究提示NPM可能通過改變其分布與表達、與原癌基因和抑癌基因的互相作用、蛋白質修飾來調控腫瘤細胞誘導分化[23]。

臨床方面，大多將AFP當做肝癌標志物來應用。Wang T在研究[24]中發現NPM自身抗體在甲胎蛋白陰性肝癌中陽性表達率為21.4%。任鵬飛還發現自身抗體聯合診斷AFP陰性的肝癌的陽性率為89.7%[16]。說明血清NPM對進一步篩選AFP陰性肝癌病例仍有潛在價值，可為AFP陰性病例診斷提供新思路。曾有研究[16]提示AFP聯合NPM在內的自身抗體檢測肝癌的陽性檢出率為96.6%，表明各生物標志物聯合診斷可不同程度上提高原發性肝癌檢出率[25]。本試驗統計分析NPM與AFP、CEA、CA199四項聯合診斷原發性肝癌敏感度提高至63.0%，AUC=0.740，高于各指標單獨診斷價值。此時特異度稍降為78.1%，結合早期肝癌癥狀體征難以察覺、檢出難度大等特點，此時對高敏感性指標的要求更為迫切，可見，聯合診斷不僅可使診斷敏感度大幅提升，還不會明顯影響特異度，有助于早期肝癌的診治。

綜上所述，PHC血液中NPM過表達，在早期肝癌及肝硬化中尤甚，提示NPM與腫瘤發生發展存在良好相關性。同時對于APF陰性PHC病例而言NPM仍存在不錯的檢出率。NPM與其他常見腫瘤標志物聯合診斷PHC效率可得到顯著提升，可見其具備成為肝癌腫瘤標志物的潛力。目前尚不知曉NPM通過何種生物機制在原發性肝癌發生轉化過程中發揮作用，研究其作用機制可能為肝癌化學治療、靶向治療以及耐藥性等方面提供全新解題思路，故研究其病理機制可作為本試驗的后續主要方向。