川產姜黃須根大類成分分析及提取工藝優化

陳嘉輝，吉責小平，殷中瓊，張 翅，鄒元鋒*

(1.四川農業大學天然藥物研究中心，成都 611130；2.四川省平昌縣人民政府，四川 平昌 636400)

姜黃為姜科植物姜黃(Curcumalonga)的干燥根莖，分布于四川、云南及貴州等地[1]。有破血行氣，通經止痛之功效[2]。姜黃素是中藥姜黃的重要有效成分，其化學結構如圖1所示，具有特殊的二酮類結構，可以對活性氧具有抑制作用[3]。目前，姜黃素已被證實有抗炎、抗氧化、降血脂和抗腫瘤等多種藥理作用[4-5]，廣泛應用于醫藥保健產業之中。

圖1 姜黃素的化學結構式

四川省是姜黃的道地產區，其中犍為、沐川一帶氣候濕潤，種植姜黃已有千年歷史，生產面積大，產量占全國姜黃的一半以上[6]。但是，由于疫情沖擊，姜黃種植面積萎縮，川產姜黃由于有效成分含量更高[6]，具有更好的藥用價值，價格高于云南產姜黃和進口姜黃，存在一定的供需缺口。此外，四川每年生產大量的姜黃須根，大多被棄用，造成極大的資源浪費及環境問題，但是姜黃的非藥用部位也含有相似的化學活性成分[7]。因此，加強對姜黃須根的研究和利用是很有必要的。從姜黃中提取有效成分的方法很多，包括溶劑提取法、酸堿提取法、酶提取法和超聲波輔助提取法等[8]。溶劑提取法由于其工藝簡單，提取成本低，所以本次試驗采用溶劑法提取姜黃須根的相應成分。故本試驗擬在分析其大類成分組成情況下，采用Box-Behnken設計-響應面分析法優化須根姜黃素的提取工藝，為進一步開發利用姜黃須根以及后期研究奠定基礎。

1 材料

1.1 原料

本實驗的主要材料為姜黃須根，從樂山犍為縣姜黃產區采集，經鑒定為姜科植物姜黃Curcumalonga的須根。

1.2 藥品

葡萄糖標準品(分析純，成都科隆化學品有限公司)；蘆丁標準品(純度≥98%，北京索萊寶科技有限公司)；姜黃素標準品(純度≥95%，北京索萊寶科技有限公司)；乙醇(分析純，成都科隆化學品有限公司)；苯酚(分析純，成都科隆化學品有限公司)；亞硝酸鈉(分析純，成都科隆化學品有限公司)；硝酸鋁(分析純，成都科隆化學品有限公司)。

1.3 儀器

紫外-可見光分光光度計(上海尤君儀器公司)；電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；恒溫干燥箱(成都一科儀器設備有限公司)。

2 方法

2.1 姜黃須根大類成分分析

根據文獻[9-11]所示方法，制作葡萄糖、蘆丁和姜黃素的標準曲線。

根據文獻[8,11-12]所示條件分別提取須根多糖、黃酮和姜黃素。按式(1)中方法計算姜黃須根中大類成分的提取率。

Y=(M0/M)×100%

(1)

式中：

Y——姜黃大類成分提取率，%；

M0——姜黃大類成分的質量，g；

M——姜黃須根的質量，mg。

2.2 姜黃須根姜黃素提取工藝優化

2.2.1 單因素實驗 以須根姜黃素的提取率為指標，考察溫度、溶劑體積倍數、乙醇濃度、提取時間四個因素對姜黃素得率的影響。

2.2.2 Box-Behnken響應面實驗 利用Design Expert 10.0.1軟件進行優化設計，根據單因素實驗結果，選取其中三個因素為主要考察因素，以須根姜黃素提取率為響應值，設計響應面優化實驗。

根據回歸模型預測條件進行驗證，將該條件重復進行試驗三次，判斷最終姜黃須根中姜黃素提取率與預測值是否接近，從而得到最佳提取條件。

3 結果

3.1 姜黃須根大類成分分析結果

3.1.1 標準曲線 得到的葡萄糖標準曲線吸光度(y)與濃度(x)的線性回歸方程為y=5.7314x-0.0198(R2=0.9956)，在0.01～0.10 mg/mL之間線性關系良好。

得到的蘆丁標準曲線吸光度(y)與濃度(x)的線性回歸方程為y=3.1x-0.0008(R2=0.9988)，在0.004～0.040 mg/mL之間線性關系良好。

得到的姜黃素標準曲線吸光度(y)與濃度(x)的線性回歸方程為y=71.867x+0.0096(R2=0.9976)，在0.001～0.010 mg/mL之間線性關系良好。

3.1.2 大類成分提取率的結果及分析 所得各類成分的提取率如表1所示。可見，通過溶劑回流法，姜黃須根中多糖的平均得率為三者最多，姜黃素的平均得率為三者最低。值得注意的是，朱姍薇[8]等人發現姜黃各個部位姜黃素的含量對進行姜黃屬植物的分類學研究具有重要意義，姜黃植物的不同部位姜黃素的含量具有顯著差異。所以，對姜黃須根的姜黃素進行提取工藝優化不僅能減少姜黃素的浪費，加強對姜黃資源的保護，還對姜黃屬植物的分類學研究具有重要意義。

表1 姜黃須根大類成分提取率匯總

3.2 姜黃須根姜黃素提取工藝優化結果

3.2.1 單因素實驗結果

(1)提取溫度對姜黃素提取率的影響

結果如圖2所示。可見隨著溫度的升高，姜黃素的溶解率增大，須根姜黃素的提取率增大。當溫度達到90℃之后，須根姜黃素的提取率下降。其原因可能是與姜黃素特殊的二酮結構受熱分解有關。故本次實驗選擇溫度70～90℃來作為提取工藝優化的響應條件。

圖2 提取溫度對姜黃素提取率影響圖

(2)乙醇濃度對姜黃素提取率的影響

結果如圖3所示。可見隨著乙醇濃度的升高，須根姜黃素的提取率逐漸增大。當乙醇濃度達到70%之后，姜黃素的提取率逐漸下降。其原因可能是與在不同濃度的乙醇中姜黃素的溶解度不同有關。故本次實驗選擇乙醇濃度50%～70%來作為提取工藝優化的響應條件。

圖3 乙醇濃度對姜黃素提取率影響圖

(3)溶劑用量對姜黃素提取率的影響

結果如圖4所示，可見隨著溶劑用量的增大，須根姜黃素的提取率增大，但當料液比達到1:20之后，增加幅度不大。其原因可能是隨著溶劑用量的增大，姜黃素的溶出速率逐漸達到平衡。考慮到節省溶劑，故本次實驗選擇溶劑用量15～25倍來作為提取工藝優化的響應條件。

圖4 溶劑用量對姜黃素提取率影響圖

(4)提取時間對姜黃素提取率的影響

結果如圖5所示，可見隨著提取時間的增大，須根姜黃素溶出到溶劑的含量增多，姜黃素的提取率增大。當提取時間達到60min后，須根姜黃素提取率有所增大，但是幅度不高，可能是因為細胞內外姜黃素滲出滲入逐漸達到了動態平衡。為了提高提取效率，故本次實驗選擇的提取時間為60min，且不對提取時間進行工藝優化。

圖5 時間對姜黃素提取率影響

3.2.2 Box-Behnken響應面實驗結果

(1)Box-Behnken實驗設計結果

在單因素的實驗基礎上，利用Design Expert 10.0.1軟件進行優化設計，根據 Box-Behnken 的中心組合實驗設計原理，選取提取溫度(A)、溶劑用量(B)和乙醇濃度(C)三個因素為主要考察因素，以須根姜黃素提取率為響應值，設計三因素三水平的響應面優化實驗。實驗因素與水平和中心組合設計結果如表2和表3所示。

表2 響應面實驗因素與水平

表3 響應面實驗中心組合設計及結果

(2)回歸方程及方差分析結果

根據Design Expert 10.0.1軟件，對所得數據進行回歸方程擬合分析，得到的二次回歸方程為：姜黃素提取率(%)=0.27+0.015A+0.052B+6.312×10-3C+8.650×10-3AB-2.250×10-3AC-1.325×10-3BC-0.029A2-0.058B2-0.013C2(R2=0.9835)。

F值的大小可體現各個工藝條件對須根姜黃素提取率的影響，因此實驗因素對響應值影響大小的順序如下：B(溶劑用量)>A(溫度)>C(乙醇濃度)。

表4 響應面實驗方差分析

續表4

(3)響應面曲線圖分析結果

本次實驗所得到的等高線圖和3D曲線圖如圖6-8所示。可見須根姜黃素的提取率隨著任意兩個工藝因素的增加而升高，達到最高值后，再隨之下降。曲面的最高點均位于等高線范圍之內，響應面3D圖為開口向下的平滑的曲線，因此，可以選用此模型來預測須根姜黃素提取率的最優條件。

圖6 溶劑用量和溫度對須根姜黃素提取率的影響

圖7 乙醇濃度和提取溫度對須根姜黃素提取率的影響

圖8 乙醇濃度和溶劑用量對須根姜黃素提取率的影響

(4)最優條件驗證

根據回歸模型所得到的最佳提取率為：提取溫度為83.224℃，料液比為1：22.331，乙醇濃度為61.921%，在此條件下，須根姜黃素提取率最高為0.280%。考慮到實際提取條件，選擇提取溫度為83℃，料液比為1:22，乙醇濃度為60%的條件下進行驗證實驗，得到的須根姜黃素提取率為0.277%，相對誤差為1.64%，與預測值接近，表明此回歸模型有效、可靠，可用于須根姜黃素的提取。

4 討論與結論

姜黃素廣泛應用于醫藥、食品和紡織行業，具有極高的經濟價值，預計2022年全球姜黃素的市場將高達0.94億美元[13]。目前研究主要集中在對姜黃根莖的研究，對姜黃非藥用部位的研究較少。川產姜黃品質較好，隨著對姜黃素需求的增大，加強對川產姜黃非藥用部位的研究，可以有效避免藥材的浪費，提高全藥材的利用度。提取姜黃須根中的大類成分，從而為姜黃的深入加工和藥材資源的合理應用提供依據。采用溶劑法提取姜黃須根的大類成分，工藝簡單，并且可以在較低的提取成本下，達到較好的藥材利用效果。并輔以響應面分析法，優化須根中姜黃素的提取條件，達到對姜黃中姜黃素的更好利用。

實驗選擇在合適條件下，對姜黃須根的多糖、黃酮和姜黃素成分進行提取，三者的平均得率分別為2.33±0.05%，1.00±0.02%和0.24±0.01%。不僅姜黃素具有極好的抗氧化能力，侯敏娜等[14]通過體外抗氧化試驗，發現姜黃多糖和黃酮也具有良好的抗氧化效果，使得對DPPH自由基的清除率顯著下降。因此，加強對姜黃非藥用部位的研究是有重要價值的。通過響應面優化實驗，各提取因素對須根姜黃素提取率的影響為：B(溶劑用量)>A(溫度)>C(乙醇濃度)，與單后松[15]等人研究的各因素對姜黃素提取率影響相同。對最佳條件進行修正后，在提取溫度為83℃，料液比為1:22，乙醇濃度為60%的條件下得到須根姜黃素的最佳提取率為0.277%，與預測值0.280%相近。說明本次實驗所得到的模型可靠，可以依據此模型來選擇須根姜黃素的最優提取條件。