酒精性肌病相關炎性因子和氧化應激標志物水平的Meta分析

汪楠 ，Oleksandr Motuziuk，Iryna Mishchenko，周穎婷

長期過量飲酒或急性酒精中毒會對各器官、系統產生負面影響，從而增加死亡率［1］。在全球范圍內，飲酒是第七大死亡風險因素。在中青年人群中，約12.2%的男性死亡歸因于酒精攝入［2］。傳統意義上，適度飲酒可以降低冠心病等疾病的發病率，但如果從遺傳流行病的角度來看，這可能是由于心肌本身的保護機制抵消了酒精的影響［3］。當酒精影響到肝臟時，會出現脂肪肝或單純性脂肪變性、酒精性肝炎和伴有肝纖維化或肝硬化的慢性肝炎；影響到心臟時，其病變特點是左心室重量增加、擴張，心室壁變薄和心室功能障礙；影響到骨骼肌時會出現酒精性肌病，肌肉會出現疼痛、萎縮等。酒精性肌病也可稱為酒精誘發的肌肉疾病，用于描述由于急性或慢性酒精攝入而引起肌肉的任何病理變化［4］。酒精性肌病的特征是Ⅱ型（無氧）肌纖維選擇性萎縮，Ⅰ型（有氧）肌纖維則相對受到保護。目前，不論是慢性酒精中毒，還是急性酒精中毒，其致病機制均涉及骨骼肌蛋白的代謝以及氧化應激［1］。

從數據庫中檢索到的文獻資料顯示，有些實驗研究集中討論酒精攝入量與骨骼肌糖原的變化或肌肉損傷程度的關系［5-8］；有些研究則側重討論酒精中毒時體內各種炎性因子的改變，比如，人們長期攝入酒精時體內細胞會通過腫瘤壞死因子α（TNF-α）增強泛素/蛋白酶體活性，從而導致蛋白質分解代謝增加；另外，人們長期攝入酒精時會加劇骨骼肌萎縮，使細胞周期調節因子及其受體激活素ⅡB的表達異常，同時改變白介素6（IL-6）的表達［9-11］。JAYASEKARA 等［1］對酒精攝入量和死亡風險之間的關系進行了回顧分析，他們總結了現有證據，與對照組相比，當酒精攝入量超過40 g/d時，酗酒者的死亡風險與攝入量間存在明顯的線性關系；ADAMS等［12］的回顧分析以酒精中毒患者為研究對象，系統回顧了細胞因子與酒精濫用之間的關系，酗酒會造成外周血中細胞因子紊亂，同時指出對照組和患者隊列中可能患有慢性炎癥性或自身免疫性疾病，這將影響細胞因子的產生，使得他們的研究存在高偏倚風險。酒精中毒對骨肌的影響不僅體現在炎性因子的改變，還會引起嚴重的氧化應激。

1 資料與方法

1.1 納入標準 （1）研究類型為動物干預研究（animal intervention studies）；（2）研究對象為實驗鼠；（3）實驗組模型構建方式為酒精喂養或酒精腹腔注射，對照組為空白或安慰劑；（4）研究文獻為全文文獻，語種為中文、英文；（5）對署名為同一作者或來自同一單位的實質內容重復的文獻，僅選擇其中1篇文獻納入研究；（6）主要結局指標：氧化應激標志物包括谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）；炎性細胞因子：胰島素樣生長因子1（insulinlike growth factor 1，IGF-1）mRNA、IL-6 mRNA。

1.2 排除標準 （1）研究對象為人；（2）病例報告；（3）非原創（即評論、致編輯的信函、專家意見等）；（4）重復文獻；（5）無法獲得的文獻；（6）描述酒精有關神經病變的文獻；（7）未提供相關結局指標或結局指標無法提取。

1.3 文獻檢索范圍及檢索策略 依照Cochrane干預措施系統評價手冊5.1版［13］要求制定檢索策略：采用主題詞與自由詞結合的檢索方法，使用計算機檢索維普網（VIP）、萬方數據知識服務平臺（Wanfang Data）、中國知網（CNKI）、Web of Science、PubMed、Embase、Cochrane Library，所有數據庫的檢索時間為1990-02-01至2021-08-31。中文檢索詞包括酒精性肌病，IGF-1 mRNA，IL-6 mRNA，MDA，GSH；英文檢索詞包括Alcoholic myopath，IGF-1 mRNA，IL-6 mRNA，MDA，GSH，non-alcoholic，liver disease，rhabdomyolysis，Musculoskeletal diseases。

1.4 文獻的方法學質量評價 本研究采用SYRCLE動物實驗偏倚風險評估工具［10］對文獻質量進行評價，該工具包含10個條目，22個附加的信號問題，評價涉及選擇偏差、表現偏差、檢測偏差、損耗偏差、報告偏差和其他偏差。10個條目分別為：分配序列生成或應用是否足夠；各基線是否相同或是否調整了潛在混雜因素；分配隱藏是否足夠；實驗過程中動物是否被隨機分配；是否對研究者和動物飼養者施盲；結果評價中是否經過隨機選擇；是否對結果評價者采用盲法；不完整的數據是否被報告；研究報告是否與選擇性結果報告無關；是否不存在其他偏倚。評價結果以Low risk（L）、Unclear risk（U）和High risk（H）分別代表低偏倚風險、不確定偏倚風險和高偏倚風險［10］。

1.5 資料提取 由2名研究員分別下載文獻、整理文獻，兩名研究員按照納入、排除標準獨立進行文獻閱讀和資料提取。首先評估標題和摘要，排除明顯不相關的研究后由研究員閱讀全文后提取相關資料，并交由第3名研究員審核。對存在爭議的部分，用以下方法解決：小組討論、第三方仲裁及專家咨詢。若所需資料在文獻中未提及，盡可能與原作者取得聯系并獲得。提取資料的內容包括：第一作者、發表時間、實驗鼠類型、分組方式、樣本量（實驗組、對照組實驗鼠只數）、建模方式、飼養時間、取材部位、結局指標、分配隱藏、隨機序列生成、盲法（單盲或雙盲、評估者的盲法）、缺失數據、選擇性報告和其他偏差等。

1.6 統計學方法 采用RevMan 5.4.1 軟件進行Meta分析。計量資料統計量采用加權均數差（weighted mean difference，WMD）、標準化均數差（standard mean difference，SMD）及其95%置信區間（confidence interval，CI）分析；計數資料采用RR及其95%CI表示。對納入文獻采用I2和P值進行異質性檢驗，若I2≤50%且P≥0.1，則表示各研究間統計學異質性較小，采用固定效應模型進行Meta分析；若I2＞50%且P＜0.1，表示納入的研究間存在統計學異質性，選用隨機效應模型進行Meta分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 文獻檢索結果 初步檢索到的文獻共771篇，其中中文文獻59篇，經過閱讀、篩選，排除綜述13篇、研究低血鉀肌病2篇、信函1篇、非目標數據源文獻25篇、非中文或英文文獻6篇。最終納入17篇文獻［9-11，14-27］。文獻檢索流程見圖 1。

圖1 文獻篩選流程圖Figure 1 Flow diagram of literature screening

2.2 納入文獻基本特征 本研究共納入17篇動物干預研究［9-11，14-27］，共包括332只實驗鼠，研究對象均是大鼠或小鼠。納入研究建立實驗鼠酒精中毒模型的方式分為急性和慢性兩種。慢性酒精中毒建模方法：實驗動物在恒溫下飼養并暴露于12 h∶12 h的明暗循環，經過1～2周的隔離飼養，給實驗組動物的固體或流質食物中逐漸添加酒精至目標濃度（20%、30%、35%、36%、37%或56%），觀察療程為：4～35周；急性酒精中毒建模方法：經腹腔注射乙醇濃度為75 mmol/kg，觀察時間為注射乙醇后2.5 h，見表1。

表1 納入文獻的基本特征Table 1 Basic characteristics of the included literature

2.3 納入文獻質量評價 納入文獻整體質量良好，有部分選擇偏倚。（1）隨機分配方法：只有4項研究［10，21-22，27］提及隨機分組，但沒有描述具體的隨機分組方法。（2）分配方案隱藏：研究均未分配隱藏。（3）研究結局盲法評價情況：研究均未對研究結局進行盲法評價。（4）結局數據的完整性：研究的結局數據均具有完整性。（5）選擇性報告研究結果情況：研究均未選擇性報告研究結局。（6）其他偏倚來源：研究均未提及其他偏倚情況。納入研究偏倚風險評價見圖 2，偏倚風險總結見圖 3（彩圖請掃描正文首頁二維碼）。

圖2 偏倚風險評價Figure 2 Assessment of risk of bias

圖3 納入研究的偏倚風險評價結果Figure 3 Assessment summary of risk of bias of included studies

2.4 Meta分析結果

2.4.1 IGF-1 mRNA表達水平 共6篇文獻［14-15，17，21-22，24］檢測了肌肉組織中IGF-1 mRNA表達水平，各研究間存在異質性（I2=93%，P＜0.000 01），采用隨機效應模型進行分析，結果顯示實驗組IGF-1 mRNA的表達水平低于對照組，差異有統計學意義〔SMD=-3.09，95%CI（-5.75，-0.43），P=0.02〕。進一步進行亞組分析，探索異質性來源，以采樣部位作為分組依據，分為兩個亞組進行亞組分析，結果顯示腓腸肌亞組研究異質性低（I2=0%，P＜0.000 01）。實驗組IGF-1 mRNA的表達水平低于對照組，差異有統計學意義〔SMD=-5.21，95%CI（-6.25，-4.17），P＜0.000 01〕；跖肌亞組實驗組和對照組IGF-1 mRNA表達水平比較，差異無統計學意義〔SMD=0.85，95%CI（-3.20，4.90），P=0.68〕，亞組分析顯示，采樣部位可能是異質性主要來源，見圖 4。

圖4 IGF-1 mRNA表達水平亞組分析森林圖（腓腸肌和跖肌亞組）Figure 4 Forest plot of subgroup analysis of IGF-1 mRNA expression levels （gastrocnemius and plantaris）

2.4.2 IL-6 mRNA 表達水平 5 篇文獻［10-11，17，21-22］研究了模型鼠酒精性肌病IL-6 mRNA表達情況，研究之間異質性較低（I2=41%，P=0.15），采用固定效應模型進行Meta分析。結果顯示，實驗組IL-6 mRNA表達水平高于對照組，差異有統計學意義〔SMD=3.75，95%CI（2.93，4.57），P＜0.000 01〕，見圖 5。

圖5 IL-6 mRNA表達水平森林圖Figure 5 Forest plot of IL-6 mRNA expression levels

2.4.3 MDA 7 篇文獻［9，18-20，23，25-26］報道了 MDA，但是WANG等［18］的研究從比目魚肌和跖肌這個兩部位取材，同時測定了MDA，有2項數據。異質性檢驗結果提示納入研究間無異質性（I2=0%，P=0.93），采用固定效應模型進行Meta分析，結果顯示實驗組MDA高于對照組，差異有統計學意義〔SMD=0.92，95%CI（0.63，1.22），P＜0.000 01〕，見圖 6。

圖6 MDA水平森林圖Figure 6 Forest plot of subgroup analysis of the levels of MDA

2.4.4 GSH 6篇文獻，7項研究報道了 GSH［11，16-19，27］，研究間存在異質性（I2=93%，P＜0.000 01），使用隨機效應模型進行分析，結果顯示實驗組GSH低于對照組，差異有統計學意義〔SMD=-4.20，95%CI（-6.24，-2.17），P＜0.000 01〕。進一步進行亞組分析，探索異質性來源，按采樣部位將納入的研究分為跖肌亞組和比目魚肌亞組，結果顯示亞組內依然存在異質性（I2=91%，P＜0.000 01）。跖肌亞組中實驗組GSH低于對照組，差異有統計學意義〔SMD=-5.08，95%CI（-8.01，-2.14），P=0.000 7〕；比目魚肌亞組中實驗組和對照組GSH比較，差異無統計學意義〔SMD=-2.91，95%CI（-9.27，3.45），P=0.37〕，取樣部位不是其異質性來源，見圖7。

圖7 GSH水平亞組分析森林圖（跖肌組和比目魚組）Figure 7 Forest plot of subgroup analysis of the levels of GSH（plantaris and soleus）

將建模時使用的酒精濃度作為分組依據進行亞組分析，酒精濃度20%～36%為A組，酒精濃度＞36%～56%為B組。亞組分析結果顯示，A組異質性降低（I2=58%，P=0.07），其實驗組GSH低于對照組，差異有統計學意義〔SMD=-5.91，95%CI（-8.32，-3.49），P＜0.000 01〕；B組異質性依然校高（I2=95%，P＜0.000 01），其實驗組實驗組與對照組GSH比較，差異無統計學意義〔SMD=-2.33，95%CI（-4.70，0.04），P=0.05）〕。亞組分析顯示建模時酒精濃度可能為部分異質性的來源，見圖8。

圖8 GSH水平亞組分析森林圖（A組酒精濃度范圍：20%～36%；B組酒精濃度范圍：＞36%～56%）Figure 8 Forest plot of subgroup analysis of levels of GSH（A：alcohol concentration range 20%～36%；B：alcohol concentration range＞36%～56%）

3 討論

酗酒者可以出現多處器官損傷，從營養不良到明顯的肝損傷，如終末期肝硬化，醫務工作者關注酒精引起的肝損傷卻容易忽視其引起的骨骼肌病變。由酒精誘發的肌肉疾病稱為酒精性肌病，其包括急性酒精性肌病，約占酗酒者的1%，其特征是肌肉出現急性腫脹疼痛；慢性酒精性肌病是酒精中毒的常見并發癥，約占酗酒者的50%，受影響患者表現為近端肌肉無力［4］，其機制為長期飲酒會降低Ⅱ型肌纖維的肌肉（如腓腸肌和/或跖肌）蛋白質含量和蛋白質合成［28］。同時，酒精性肌病的特點是出現炎癥，氧化應激等。在早期，酒精引起的肌肉疾病較少受到人們的關注［29］。而事實上，酒精誘發的肌病發病率是常見的遺傳性肌病（即腎上腺肌病）的10倍。通過檢索發現針對上述酒精性肌病的薈萃分析暫有空缺。因此本文將選擇多個炎性因子和氧化應激標志物，采用Meta分析的方式對酒精中毒動物模型的研究做出系統評價，以探討炎性因子和氧化應激標志物在酒精性肌病基礎研究和臨床研究中的應用價值。

本研究納入17篇文獻，Meta分析結果提示，以IGF-1 mRNA作為指標時，共納入6項研究［14-15，17，21-22，24］，被納入研究之間異質性較大，進行亞組分析后顯示腓腸肌亞組異質性低，在酒精中毒后肌肉中的IGF-1 mRNA表達水平明顯下降，跖肌亞組仍存在較高異質性，通過森林圖中的數據發現異質性來源于OTIS等［17］在2009年的研究，該研究測得實驗組跖肌中IGF-1 mRNA表達水平高于對照組，與同時納入的其他研究有差異。可能的原因是，當肌肉發生慢性酒精中毒時，IGF-1顯著降低［30］。LANG 等［15］用 IGF-1和 IGF結合蛋白3（IGFBP-3）組成的二元復合物處理酒精中毒的大鼠時，其體內的真核翻譯起始因子4E結合蛋白1（4E-BP1） 磷酸化仍然降低，表明人為地增加IGF-1以及相關蛋白無法改變大鼠肌肉萎縮的事實。這一研究說明，IGF-1 mRNA的表達水平與酒精中毒沒有直接關系。這可能是IGF-1 mRNA作為指標時研究之間異質性較大的原因。另外，所有以IGF-1 mRNA為指標的研究中只有OTIS等［17］的建模時間長達35周，長時間的酒精喂養可以使得IGF-1 mRNA在肌肉中的表達形成了新的平衡。BORRISSER-PAIRó等［31］在2013年對酒精中毒患者的研究也證實了IGF-1表達量在慢性酒精中毒患者體內只是略微下降，但是沒有統計學意義（P=0.069）。因此在以后的研究中，如果將IGF-1 mRNA作為指標，既要謹慎地選擇樣本來源，又要妥善選擇建模時間。

MDA是自由基反應產生的主要降解產物，故MDA可反映機體內脂質過氧化的程度，間接反映細胞氧化應激的程度。納入的 7 項研究［9，18-20，23，25-26］，實驗組與對照組相比，MDA平均提高了約0.9倍，實驗組MDA水平均高于對照組。HUANG等［32］指出，過量飲酒可以導致人體內MDA水平升高。MDA水平不僅反映了脂質過氧化水平，其與線粒體氧化磷酸化的損害也有關。在酒精性肌病患者體內，MDA與蛋白質形成加合物，通過引起膜磷脂過氧化而發揮細胞毒性作用，增加膜通透性并損害膜功能，最終損傷肌細胞［33］。IL-6是白介素的一種，其作為促炎細胞因子和抗炎性肌球蛋白起作用。以IL-6 mRNA作為指標時，納入5項研究［10-11，17，21-22］，實驗組IL-6 mRNA表達量均高于對照組，這一結果與GONZáLEZ-REIMERS等［34］的臨床研究一致。IL-6 mRNA、MDA作為結局指標時，各研究之間異質性較小，且各研究中實驗組與對照組之間差異是有統計學意義的。因此使用它們作為標志物時，有較強穩定性，而且動物實驗結果與臨床研究結果有一致性。當使用GSH作為結局標志物時，異質性檢驗顯示各研究之間有很大的異質性。酒精中毒后的組織損傷可能是由于活性氧（ROS）產生增加所致，DEKEYSER等［11］和OTIS等［16］的研究均支持Ⅱ型肌纖維中對酒精引起的氧化還原狀態的改變特別敏感，其原因是Ⅱ型肌肉中的GSH水平較低，存量不足、消耗增加使得GSH水平出現明顯下降，導致Ⅱ型肌纖維無法拮抗ROS對肌纖維的損害。WANG等［18］和初海鷹等［19］的研究均使用了以糧食為原料的釀造食用酒（56%）作為建模手段。糧食釀造的食用酒與單純的酒精存在區別，以糧食為原料釀造的酒中含有多種微量元素，這些元素可能對實驗結果產生影響。一項研究也證實了在釀酒的過程中確實會產生很多抗氧化物質［35］。

綜上所述，盡管骨骼肌萎縮時與體內IGF-1水平下降有某種關聯，并不建議將IGF-1或IGF-1 mRNA作為研究酒精性肌病的指標，或者應該謹慎考慮其價值。MDA和GSH均與氧化應激有關，且能較準確反映出酒精中毒時肌肉的局部的氧化壓力，是非常穩定有價值的標志物。但是在使用GSH的時候，一定要關注實驗動物的分組方法、酒精的類型及建模酒精的濃度，這樣才能得出穩定且科學的結論。

本研究存在以下的問題：（1）在建模方式和取樣部位存在差異：本研究共納入17項研究中，酒精的固體飼料喂養和酒精的液體飼養都使用的是統一的標準，但是酒精中毒模型鼠的建模方法各不相同，可能會造成偏倚，其中有4項研究沒有詳細注明取材部位，只說明取材于骨骼肌；（2）納入研究的方法學質量不高：納入的17項研究中僅4項研究報道使用了隨機分組方法，整體研究質量評價傾向于偏倚風險未知，可能對Meta分析結果產生影響，提示未來仍需開展方法學質量較高的動物干預實驗及臨床試驗來研究酒精性肌病的機制。

作者貢獻：汪楠、Oleksandr Motuziuk進行文章的構思與設計，研究的實施與可行性分析，結果的分析與解釋，撰寫論文；汪楠、Oleksandr Motuziuk、Iryna Mishchenko進行數據收集；周穎婷進行數據整理；汪楠進行統計學處理；Oleksandr Motuziuk進行論文的修訂，負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。