一株生防菌的篩選及其抗菌活性研究

顧會戰 史洪濤 何佶弦 母明新 尹振華 孫會忠 王小東*

（1四川省煙草公司廣元市公司，四川廣元 628100；2河南科技大學農學院，河南洛陽 471003）

對于植物而言，根際環境生活的大量微生物群落通過代謝活動對植物汲取養分、生長發育、病蟲害防御等起到很好的促進作用[1-4]。從根際環境中分離出的特定功能菌在與附生植物長期協同進化的過程中形成穩定的共生關系，往往能夠產生特定的生物活性物質，從而表現出特定的功能活性，這是從特定環境篩選微生物資源（包括生防菌）的理論依據之一[5]。

煙草根際環境中存在豐富的微生物種群，包括細菌、真菌、放線菌、微藻、單細胞的原生動物等[6-7]，從煙草根際環境中篩選出生防細菌理論上是可行的，且從煙草根際環境篩選出來的生防菌對煙草具有更好的親和性，有利于對煙草真菌病害的防治。在此背景下，本研究對煙草根際土壤細菌進行了分離培養，篩選鑒定了具有顯著抑菌活性的微生物，并通過盆栽試驗驗證篩選菌株的生防效果，最后對目標菌株進行了分類鑒定。現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試土樣。采集煙草根際土壤，稱量1 g土樣加入錐形瓶內，加入10 mL無菌水，搖床振蕩10 min充分混勻后即制得10-1土壤懸浮液。另取添加9 mL無菌水的試管，取10-1土壤懸浮液1 mL加入試管并振蕩搖勻，用同樣方法依次往復，制成10-4、10-5、10-6等3個濃度梯度的土壤懸浮液，各吸取1 mL涂板，37℃恒溫培養48 h。

1.1.2 供試培養基。①NA固體培養基，供內生細菌的分離、培養及拮抗試驗用。②PDA培養基，供病原真菌的培養及拮抗試驗用。③LB液體培養基，供生防菌菌懸液制備用。

1.2 抑菌活性測定

1.2.1 菌懸液的制備。將純化細菌接入100 mL的LB液體培養基中，然后在32℃、200 r/min條件下培養24 h。取適量菌液于滅菌離心管中，12 000 r/min離心15 min，收集菌體，用無菌水懸浮并調整濃度至1.0×108CFU/mL，獲得菌株菌懸液。

1.2.2 平板對峙試驗。采用牛津杯平板對峙法，分別考察分離內生細菌對指示病原真菌黑曲霉的拮抗作用。在PDA平板中央接入黑曲霉菌餅，距菌餅一定距離對稱放置2個牛津杯，且每個牛津杯加注20 μL制備好的內生細菌菌懸液，以牛津杯注入無菌水作為對照，3次重復，置于28℃的培養箱中連續培養5～7 d，定期觀察生長情況。對照組長滿整個培養皿的3/4時，計算抑菌率，計算公式如下：

抑菌率（%）=（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100

1.3 目標菌抑菌作用應用實測試驗

測試植株的制備：用PDA培養基培養煙草白粉病病原，并制備孢子懸浮液（血球計數板檢測孢子數目，調整孢子濃度至1.0×105CFU/L）。侵染方法：取1 mL孢子懸浮液接種到植株根部，同時進行葉面噴霧，確保植株發病；以無菌水處理作對照。

將抑菌效果最好的菌株用LB液體培養基32℃搖床培養至OD=4，然后12 000 r/min離心15 min收集菌體，再用等量無菌水懸浮菌體制得測試母液。施用方法為噴霧法（葉片完全濕潤）和灌根法，施用時間為病原侵染2 d后。每個處理3次重復，以無菌水處理作對照，7 d后進行葉片病情指數及發病率調查。

煙草白粉病調查分級標準：0級，葉部無病斑出現；1級，病斑面積占葉片總面積的15%以下；2級，病斑面積占葉片總面積的15%～25%；3級，病斑面積占葉片總面積的25%～50%；4級，病斑面積占葉片總面積的50%以上。

病情指數=Σ（各級病葉數×相對級數值）/（調查總葉片數×最高級數值）×100；

防治效果（%）=（對照病情指數－處理病情指數）/對照病情指數×100。

1.4 菌株的多相分類鑒定

1.4.1 形態學觀察及生理生化特征測定。將測定菌株接種于LB固體培養基培養48 h，制樣進行光鏡和掃描電鏡下的形態觀察[8]。生理生化指標的測定方法參考文獻[9-10]。

1.4.2 菌株16S rDNA分析。將測定菌株接種于LB固體培養基，搖床過夜培養，采用試劑盒提取基因組DNA；選用通用引物 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3′）、1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR體系及操作方法參考文獻進行。測序結果提交NCBI進行比對，并采用MEGA7的N-J法構建系統發育樹[11]。

2 結果與分析

2.1 根際土壤細菌分離結果

土壤懸浮液涂布NA平板中，37℃培養2～3 d以后，平板上形成特征菌落。挑取菌落進行3次劃線純化，獲得19株細菌活體純培養物，編號為GHZ1～GHZ19。采用15%甘油于-20℃條件下保種備用。

2.2 生防活性菌株評估結果

以黑曲霉為指示菌株，分別對獲得的19株根際土壤細菌的拮抗活性進行測定，對峙試驗結果表明，GHZ05、GHZ09和GHZ12等3株菌對黑曲霉具有顯著的抑制作用，抑菌圈直徑依次為13、11、28 mm，抑菌率依次為 31.36%、40.55%、60.39%（圖1）。

2.3 菌株GHZ12的生防應用效果

盆栽試驗驗證了菌株GHZ12對煙草白粉病的生物防治效果。煙草白粉病病原侵染接種6 d后植株開始發病，初期表現為葉片正面出現黃褐色褪綠小斑，隨即在斑塊的正反兩面出現毯狀小點，漸次擴大，白粉可覆蓋葉片的大部或全部，嚴重時葉片干枯，后期偶爾可見黑色的顆粒體。由表1可知，GHZ12菌懸液的灌根、葉面噴霧和灌根+葉面噴霧3種不同處理表現出不同的生防效果，灌根+葉面噴霧混合處理在整個發病期均表現出比葉面噴霧和灌根單一處理要好的生防效果。15 d時，灌根+葉面噴霧混合處理的防治效果達到了56.50%，葉面噴霧防治效果為59.96%，2個處理的防治效果均為單一灌根處理的2倍以上。3種施用方法防治效果相互之間差異達顯著水平。驗證結果證實，GHZ12菌株對煙草白粉病的防治是有效的，在施用方法上，單一葉面噴霧和灌根+葉面噴霧均取得了較好的生防效果；灌根效果較差，不宜單獨使用。

表1 菌株GHZ12對煙草白粉病的防治效果

2.4 菌株GHZ12的分類鑒定結果

菌株GHZ12的形態特征（圖2）：菌落呈土黃色，不透明，邊緣具有齒狀突出，菌落整體隆起明顯，表面半濕潤。革蘭氏染色陰性，菌體桿形，多單生，兩端鈍圓，具有端鞭毛，長 1.3～2.2 μm，直徑 0.5～0.9 μm。

菌株GHZ12的生理生化指標測定結果呈陽性反應的項目包括明膠水解試驗、V-P試驗、檸檬酸鹽利用試驗、接觸酶試驗、脲酶水解試驗和吲哚試驗；陰性反應項目包括淀粉水解、甲基紅試驗、糖類（葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖）發酵試驗。

菌株GHZ12的16S rDNA基因擴增產物測序結果為1 496 bp，序列在GenBank比對獲得同源性較高的序列，并構建進化樹（圖3）。結果表明，菌株GHZ12與Pseudomonas sp.S35（KT890311.1）聚在同一分支。結合菌株LZ-7的形態、生理生化和分子鑒定結果，將其鑒定為假單胞菌屬菌株，暫命名為Pseudomonas sp.GHZ12。

3 討論

煙草是我國重要的經濟作物，在栽培過程中病害嚴重，通過尋找生防菌能夠實現煙草病害的綠色防控，這也是煙草行業可持續發展的技術需求[12]。本研究從煙草根際土壤中共分離出3株拮抗菌株，試驗以黑曲霉為指示菌株，3株具有拮抗活性的菌株GHZ05、GHZ09和GHZ12可初步定性為對真菌病原具有抑制作用的生防菌，具有后期深度開發的價值。

盆栽試驗證實，GHZ12對煙草白粉病具有較好的生防效果，從第5天發病開始到第15天的發病周期中，GHZ12的生防效果在各處理中均持續提高，這說明GHZ12發揮出了對煙草白粉病病原持續性的抑制作用，符合生防菌發揮作用的規律和生物學特點，可作為開發煙草白粉病生物防治的資源菌株。