基于流式細(xì)胞術(shù)的爪耳木染色體倍性與基因組大小測(cè)定

李英英 劉咲頔 王清隆* 王 鵬 王祝年

（1中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南海口571101；2中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海口實(shí)驗(yàn)站，海南海口 571101）

爪耳木（Lepisanthesunilocularis）為無患子科（Sapindaceae）鱗花木屬（Lepisanthes）常綠灌木[1]，為國家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物和海南特有滅絕級(jí)植物[2-3]。1935年爪耳木消失在人們視野，2013年人們?cè)俅伟l(fā)現(xiàn)爪耳木身影，時(shí)間跨度近80年[4]。爪耳木耐旱、耐瘠薄，是海南熱帶濱海植被中為數(shù)甚少的喬木樹種之一，是海南濱海地區(qū)較理想的造林樹種[5]。爪耳木根可入藥，具有一定的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[6]。目前，關(guān)于爪耳木基因組學(xué)的研究鮮報(bào)道，這導(dǎo)致爪耳木的研究和利用受到制約。

流式細(xì)胞術(shù)是利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行的一種單細(xì)胞定量分析和分選技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)是單克隆抗體及免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、激光和電子計(jì)算機(jī)科學(xué)等高度發(fā)展及綜合利用的高技術(shù)產(chǎn)物[7]，是測(cè)定基因組大小的常用方法。目前，流式細(xì)胞術(shù)已應(yīng)用在芭蕉、旱柳、玫瑰茄、紅麻等植物基因組大小測(cè)定上[8-11]。本研究利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)爪耳木進(jìn)行染色體倍性測(cè)定和基因組大小評(píng)估，以期為爪耳木的基因組學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

用于流式細(xì)胞術(shù)分析的爪耳木葉片采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所農(nóng)業(yè)部儋州熱帶藥用植物種質(zhì)資源圃（東經(jīng) 109°50′09″、北緯19°51′09″），葉片采摘后置于 4 ℃冰箱中保存。

內(nèi)參植物選擇橡膠7-33-97和大豆williams82的新鮮葉片，橡膠7-33-97采于海南儋州橡膠種植圃，基因組大小為1.46 GB[12]；大豆williams82由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所提供，基因組大小1.12 GB[13]。橡膠新鮮葉片采摘后存于4℃冰箱；大豆williams82為種子苗，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)藥品與儀器

供試藥品：PI溶液20 mg/L、DAPI溶液 20 mg/L、WPB解離液、GLB解離液等。

供試儀器：流式細(xì)胞儀、培養(yǎng)皿、鑷子、刀片、漏斗、試管等。

1.3 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)用爪耳木初生葉、幼葉、成葉以及橡膠7-33-97嫩葉、大豆williams82嫩葉，用流水反復(fù)沖洗3～5次，每次30 s，將葉片表面完全洗凈后用衛(wèi)生紙擦干，留待試驗(yàn)取用。分別用WPB解離液和GLB解離液解離這些葉片，篩選合適的解離液。使用DAPI溶液20 mg/L染色，利用流式細(xì)胞儀在UV光線下檢測(cè)基因組倍性。使用PI溶液20 mg/L染色，利用流式細(xì)胞儀在632 nm頻率下檢測(cè)基因組大小。

1.3.1 爪耳木染色體倍性檢測(cè)。①取材：取指甲蓋大小的爪耳木初生葉、幼葉、成葉及橡膠嫩葉、大豆嫩葉分別置于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿放在冰袋上。②解離：在培養(yǎng)皿中分別加入WPB解離液500～800 μL和GLB解離液500～800 μL，以稍微浸沒葉片為宜，用刀片垂直將葉片切碎，讓葉片碎片充分浸沒在解離液中。③染色：提前將DAPI染液2 mL加入試管中，將解離2～3 min后的樣品連同解離液通過漏斗分別加入試管中，將試管置于避光處染色20 min。④上機(jī)：上機(jī)前充分吹打混勻試管，激光選擇UV檔位，調(diào)整參照植物大豆樣品峰的位置，位置確定后保持各項(xiàng)設(shè)置不變，暫停程序后更換待測(cè)樣本，檢測(cè)待測(cè)樣本的樣品峰位置，以此計(jì)算出待測(cè)植物的倍性（待測(cè)植物倍性=待測(cè)植物樣品峰位置/參照植物樣品峰位置×參照植物倍性）。每次更換待測(cè)樣本前用超純水清洗機(jī)器。⑤數(shù)據(jù)選擇和保存：調(diào)整參照植物樣品峰位置。檢測(cè)完畢后用專用清洗液清洗，清洗后關(guān)機(jī)。

1.3.2 爪耳木基因組大小檢測(cè)。①取材：取指甲蓋大小的爪耳木初生葉、幼葉、成葉及橡膠嫩葉、大豆嫩葉分別置于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿放在冰袋上。②解離：在培養(yǎng)皿中分別加入WPB解離液500～800 μL和GLB解離液500～800 μL，以微微浸沒葉片為宜，用刀片垂直將葉片切碎，讓葉片的碎片充分浸沒在解離液中。③染色：提前在試管中加入PI染液2 mL，將解離2～3 min后的樣品連同解離液通過漏斗分別加入試管中，將試管置于避光處染色20 min。④上機(jī)：上機(jī)前充分吹打混勻試管，激光選擇632 nm波長(zhǎng)。檢測(cè)參照植物，待出現(xiàn)明顯的樣品峰后通過調(diào)整電壓等方式調(diào)整樣品峰在橫坐標(biāo)上的位置，確定好位置后保持設(shè)定不變，暫停程序后更換待測(cè)樣本，計(jì)算基因組大小（待測(cè)植物基因組大小=待測(cè)植物樣品峰位置/參照植物樣品峰位置×參照植物基因組大小）。每次更換待測(cè)樣本前用超純水清洗機(jī)器。⑤數(shù)據(jù)選擇和保存：框選樣品峰，將變異系數(shù)控制在5%以下，待檢測(cè)到的具有熒光信號(hào)的細(xì)胞核超過2 000個(gè)后，可暫停程序，保存數(shù)據(jù)。檢測(cè)完畢后用專用的清洗液清洗，清洗后關(guān)機(jī)。

2 結(jié)果與分析

2.1 爪耳木染色體倍性分析

通過調(diào)整流式細(xì)胞儀的設(shè)置，使大豆williams82樣品峰的位置穩(wěn)定在橫坐標(biāo)上四格的位置（圖1），待樣品峰基本穩(wěn)定后，暫停程序，保持設(shè)定不變，用超純水清洗上樣口。之后上機(jī)爪耳木的待測(cè)樣本，結(jié)果見圖2。爪耳木的樣品峰位置與對(duì)照樣品大豆williams82的位置十分接近。大豆williams82為二倍體，因而推測(cè)爪耳木基因組倍性與大豆williams82相同，也為二倍體。

2.2 爪耳木基因組大小鑒定

圖3為大豆williams82的PI熒光強(qiáng)度分布情況。于流式細(xì)胞儀上框選明顯的樣品峰，取具有熒光的細(xì)胞核數(shù)超過2 000個(gè)、變異系數(shù)低于5%的數(shù)據(jù)，以此保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。大豆平均值為17 012.71，變異系數(shù)為4.2%。圖4為橡膠7-33-97的PI熒光強(qiáng)度分布情況，框選的樣品峰平均值為21 472.6，變異系數(shù)為3.42%。圖5為爪耳木的PI熒光強(qiáng)度分布情況，樣品峰平均值為13 765.81，變異系數(shù)為4.42%。

依據(jù)大豆williams82基因組大小為1.12 GB，預(yù)測(cè)爪耳木基因組大小為906.24 Mb；依據(jù)橡膠7-33-97的基因組大小為1.46 GB，預(yù)測(cè)爪耳木基因組大小為935.99 Mb。因此，以大豆williams82和橡膠7-33-97作為參照的爪耳木基因組大小約為921.11 Mb。

3 結(jié)論與討論

基于流式細(xì)胞術(shù)的染色體倍性和基因組大小測(cè)定結(jié)果表明，爪耳木為二倍體植物，基因組大小約為921.11 Mb。較高的重復(fù)序列比例和較低的雜合率說明爪耳木在基因型頗為偏向純合的同時(shí)也有不小的突變概率。由于爪耳木為極小種群，種群內(nèi)基因頻率較低，加之本身基因型偏向純合，一旦在遺傳發(fā)育過程中發(fā)生基因突變或沉默、缺失，爪耳木就很難恢復(fù)到之前的狀態(tài)，這也可能是之前爪耳木瀕臨滅絕的直接原因。