社區(qū)獲得性肺炎新生兒維生素A水平變化及與中性粒細(xì)胞功能的關(guān)系*

沈懷云，周 瑞，王 磊，夏 群，刁艷霞，周夢(mèng)竹，劉 猛，徐倩倩

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科，安徽蚌埠 233004

社區(qū)獲得性肺炎(CAP)是全球兒童發(fā)病率極高和導(dǎo)致兒童死亡的主要疾病之一。5歲以下兒童CAP住院時(shí)間長(zhǎng)，常有并發(fā)癥，尤其是嬰幼兒[1-2]。新生兒因特異性和非特異性免疫功能都不健全、肺部發(fā)育還不完善等，更易罹患CAP。CAP新生兒氣管吸引物中肺泡表面活性物質(zhì)和表面活性蛋白明顯減少[3]，可導(dǎo)致其呼吸衰竭的發(fā)生，一旦呼吸衰竭往往需要進(jìn)行機(jī)械通氣，嚴(yán)重威脅新生兒健康及生命。另外，早期新生兒肺炎可能與哮喘和氣道功能受損有關(guān)，部分氣道損害可以持續(xù)到成年，新生兒肺炎可能是成人慢性阻塞性肺疾病的主要危險(xiǎn)因素[4]。維生素A (VA)屬于一種脂溶性維生素，與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)。維生素A缺乏(VAD)或亞臨床維生素A缺乏(SVAD)不僅能造成機(jī)體黏膜屏障破壞，而且可減弱機(jī)體的免疫功能，使小兒易患呼吸道感染性疾病。本研究以CAP新生兒為研究對(duì)象，檢測(cè)不同病原體感染所致的CAP新生兒外周血VA水平、中性粒細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)，并分析CAP新生兒VA水平與中性粒細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 以2019年11月至2021年11月在本院新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房住院治療的62例CAP新生兒為研究對(duì)象(CAP組)，選擇同期在本院兒科門(mén)診體檢的30例健康新生兒作為對(duì)照組。本研究選擇的新生兒CAP包括院外感染院外發(fā)病和院外感染入院后在潛伏期內(nèi)發(fā)病的患兒，不包括在醫(yī)院內(nèi)感染的院內(nèi)或院外發(fā)病的患兒。所有CAP新生兒病例均符合第8版《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》和《兒童社區(qū)獲得性肺炎管理指南：2013修訂：上》[5]中CAP的診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)咳嗽，氣促，痰鳴，伴或不伴發(fā)熱、黃疸等癥狀；(2)表現(xiàn)為發(fā)紺、吐沫或伴呻吟、呼吸困難或三凹征；(3)雙肺聞及呼吸音粗或干、濕啰音；(4)X線胸片顯示為斑點(diǎn)狀條絮影或斑片狀、片狀陰影，伴或不伴肺氣腫。排除標(biāo)準(zhǔn)：新生兒患先天性畸形或先天性遺傳代謝病、患兒母親孕期或患兒住院前補(bǔ)充過(guò)VA、免疫調(diào)節(jié)劑。CAP新生兒胎齡(39.22±1.02)周，日齡中位數(shù)是17 d(14～25 d)，男32例、女30例，體質(zhì)量(3.59±0.51)kg。對(duì)照組新生兒胎齡(39.15±1.38)周，日齡中位數(shù)是16 d(12～25 d)，男18例、女12例，體質(zhì)量(3.51±0.54)kg。CAP組與對(duì)照組胎齡、日齡、性別、體質(zhì)量具有可比性，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究已通過(guò)本院倫理委員會(huì)審核和批準(zhǔn)，所有新生兒家長(zhǎng)均簽署知情同意書(shū)。入選的CAP新生兒依據(jù)不同病原體感染分為病毒感染組、細(xì)菌感染組、病毒與細(xì)菌混合感染組(混合感染組)。病毒感染組咽拭子標(biāo)本中呼吸道病毒抗原檢測(cè)陽(yáng)性；細(xì)菌感染組痰細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性；混合感染組咽拭子標(biāo)本中呼吸道病毒抗原檢測(cè)陽(yáng)性，同時(shí)痰細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性。

1.2儀器與試劑 血清視黃醇檢測(cè)儀器為WATERS公司的高效液相色譜儀；中性粒細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)測(cè)定所用菌株為金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29213。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 所有新生兒入院后或于門(mén)診在空腹?fàn)顟B(tài)下抽取2管外周靜脈血3 mL，將其中一管血注入無(wú)菌抗凝管，迅速搖勻、離心10 min后，收集500 μL血清置于1 mL滅菌管中，-80 ℃冰箱內(nèi)保存用于檢測(cè)血清視黃醇；另一管肝素鈉抗凝血用于測(cè)定中性粒細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)。

1.3.2呼吸道病毒抗原檢測(cè) CAP新生兒在入院時(shí)采集咽拭子標(biāo)本，利用免疫熒光法進(jìn)行呼吸道病毒抗原(包括呼吸道合胞病毒，腺病毒，流感病毒A、B型，副流感病毒1型、2型、3型)檢測(cè)。

1.3.3痰細(xì)菌培養(yǎng) CAP新生兒在入院時(shí)吸取其痰液標(biāo)本，接種至培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作，再于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育72 h后觀察結(jié)果，并進(jìn)行細(xì)菌種類鑒定。

1.3.4血清視黃醇檢測(cè) 采用高效液相色譜法測(cè)定血清視黃醇濃度來(lái)評(píng)估VA營(yíng)養(yǎng)狀況。血清視黃醇濃度<0.70 μmol/L為VAD，0.35～0.70 μmol/L為SVAD，<0.35 μmol/L為臨床型VA缺乏(CVAD)，>0.70～1.05 μmol/L為可疑亞臨床型VA缺乏(SSVAD)，>1.05 μmol/L為VA水平正常[6]。

1.3.5中性粒細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)測(cè)定 將金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29213置水浴中加熱至100 ℃共10 min以殺死細(xì)菌，再以無(wú)菌生理鹽水稀釋成6×108/mL備用；吸取60 μL肝素鈉抗凝血液置于潔凈凹玻片的凹孔內(nèi)，加上述備用的葡萄球菌菌液20 μL，進(jìn)行充分混勻；再加入鋪有濕紗布的有蓋容器中，并置于37 ℃溫箱中作用30 min，期間每隔10 min搖勻一次；作用完畢后，吸取1小滴混合液置于潔凈的載玻片一端，推成薄片、晾干，按照說(shuō)明書(shū)采用快速瑞-姬氏染色劑染色10 min，清水沖洗和晾干后在油鏡下隨機(jī)尋找100個(gè)中性粒細(xì)胞，計(jì)算中性粒細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)(吞噬率=100個(gè)中性粒細(xì)胞中吞噬細(xì)菌的細(xì)胞數(shù)/100×100%，吞噬指數(shù)=100個(gè)中性粒細(xì)胞中吞噬細(xì)菌的總數(shù)/100)[7]。

2 結(jié) 果

2.1CAP新生兒不同病原體感染分組情況 CAP組新生兒中，病毒感染組28例(呼吸道合胞病毒13例、流感病毒A型3例、流感病毒B型2例、副流感病毒1型6例、副流感病毒2型3例、腺病毒1例)，其中男15例、女13例；細(xì)菌感染組21例(肺炎克雷伯菌8例、肺炎鏈球菌6例、大腸埃希菌3例、金黃色葡萄球菌3例、流感嗜血桿菌1例)，其中男11例、女10例；混合感染組13例(呼吸道合胞病毒6例、流感病毒A型3例、流感病毒B型1例、副流感病毒1型2例、副流感病毒3型1例、肺炎鏈球菌5例、肺炎克雷伯菌3例、大腸埃希菌2例、金黃色葡萄球菌1例、流感嗜血桿菌1例、副流感嗜血桿菌1例)，其中男6例、女7例。

2.2各組外周血VA水平、中性粒細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)比較 CAP組VA水平、中性粒細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；病毒感染組、細(xì)菌感染組、混合感染組之間VA水平、中性粒細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組外周血VA水平、中性粒細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)比較

2.3CAP組與對(duì)照組VA缺乏情況比較 CAP組CVAD、SVAD發(fā)生率高于對(duì)照組，對(duì)照組SSVAD發(fā)生率高于CAP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 CAP組與對(duì)照組VA缺乏情況比較[n(%)]

2.4CAP組中VA<0.70 μmol/L患兒與VA≥0.70 μmol/L患兒中性粒細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)比較 將CAP組新生兒按血清視黃醇濃度分為VA<0.70 μmol/L患兒及VA≥0.70 μmol/L患兒，VA<0.70 μmol/L患兒中性粒細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)顯著低于VA≥0.70 μmol/L 患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 CAP組中VA<0.70 μmol/L與≥0.70 μmol/L患兒中性粒細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)比較

3 討 論

3.1CAP新生兒外周血VA水平變化 VA為一組含有脂環(huán)的不飽和一元醇，以視黃醇、視黃醛和視黃酸的形式存在，其中生物活性最強(qiáng)的為視黃酸。目前，兒童VA缺乏仍普遍存在，是全球一個(gè)突出的公共健康問(wèn)題[8]。長(zhǎng)期VA缺乏會(huì)導(dǎo)致兒童失明、生長(zhǎng)發(fā)育落后、免疫受損和死亡風(fēng)險(xiǎn)增加。近年來(lái)已有較多學(xué)者開(kāi)展機(jī)體VA水平與呼吸道感染性疾病關(guān)系方面的研究。有研究者觀察發(fā)現(xiàn)血清VA水平與兒童反復(fù)呼吸道感染發(fā)生率呈負(fù)相關(guān)[9]。尤珮等[10]報(bào)道CAP患兒血清VA水平出現(xiàn)不同程度的下降，VA缺乏檢出率高于健康兒童。劉琳等[11]在研究中證明血清 VA水平與兒童肺炎的發(fā)生、病程、病情嚴(yán)重程度具有相關(guān)性。最新研究表明新型冠狀病毒肺炎患者的血漿VA水平在急性炎癥期間降低，且VA水平降低程度與患者并發(fā)急性呼吸窘迫綜合征及病死率顯著相關(guān)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)CAP新生兒血清VA水平低于健康新生兒，CVAD、SVAD發(fā)生率高于健康新生兒，而病毒感染組、細(xì)菌感染組、混合感染組之間的VA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能與感染后患兒VA吸收減少，而消耗和排出增加等因素有關(guān)。另外，健康新生兒SSVAD發(fā)生率高于CAP新生兒，表明健康新生兒VA仍處于低水平。

3.2CAP新生兒中性粒細(xì)胞吞噬功能變化 中性粒細(xì)胞是人體非特異性免疫防御屏障的重要組成部分，并與機(jī)體特異性免疫功能密切相關(guān)，它們常參與機(jī)體對(duì)外源性病原體和內(nèi)源性細(xì)胞碎片的清除，在很多呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。有研究證明中性粒細(xì)胞同時(shí)表達(dá)IL-12Rβ1和IL-12Rβ2，通過(guò)激活STAT4，從而抵抗病原體的感染[13]。HOR等[14]觀察到小鼠的中性粒細(xì)胞對(duì)于效應(yīng)T細(xì)胞遷移到受Ⅰ型單純皰疹病毒感染的皮膚是必不可少的。因此，中性粒細(xì)胞對(duì)機(jī)體T細(xì)胞的特異性免疫具有調(diào)節(jié)作用。新生兒中性粒細(xì)胞的生成及儲(chǔ)備均比較少，且功能不足，在患有感染性疾病后，會(huì)增加中性粒細(xì)胞的消耗，從而降低中性粒細(xì)胞吞噬功能和殺菌活性。國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道肺炎支原體肺炎患兒外周血中性粒細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)較健康對(duì)照組下降，表明患兒肺部感染后，機(jī)體免疫功能紊亂，表現(xiàn)為免疫功能低下[7]。本研究中CAP組中性粒細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)顯著低于對(duì)照組，但病毒感染組、細(xì)菌感染組、混合感染組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明病原微生物感染削弱了新生兒中性粒細(xì)胞的吞噬功能，導(dǎo)致其肺部感染的發(fā)生。因此，促進(jìn)中性粒細(xì)胞功能成熟的臨床干預(yù)可能會(huì)增強(qiáng)新生兒免疫功能，從而降低新生兒發(fā)生CAP的風(fēng)險(xiǎn)。

3.3VA通過(guò)中性粒細(xì)胞吞噬功能變化影響CAP新生兒非特異性免疫功能 VA不僅可以維持機(jī)體視力、生長(zhǎng)發(fā)育和上皮、呼吸道等黏膜組織的完整性，還參與促進(jìn)免疫系統(tǒng)的發(fā)育，在機(jī)體免疫功能中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，從而提高機(jī)體抵御多種感染性疾病的能力。VA在呼吸道感染患兒免疫功能的發(fā)展中是一個(gè)至關(guān)重要的因素，尤其是對(duì)患兒特異性免疫如細(xì)胞免疫的影響已有較多報(bào)道。楊曉祥等[15]研究發(fā)現(xiàn)反復(fù)呼吸道感染兒童VA水平及免疫功能指標(biāo)均降低，VA缺乏者CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞水平下降。朱長(zhǎng)龍等[16]也報(bào)道反復(fù)呼吸道感染患兒血清VA水平與T細(xì)胞免疫密切相關(guān),在一定范圍內(nèi)其水平越高,T細(xì)胞免疫能力越強(qiáng)。而本研究通過(guò)比較CAP組中VA<0.70 μmol/L患兒與VA≥0.70 μmol/L患兒的中性粒細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)，發(fā)現(xiàn)VA<0.70 μmol/L患兒的中性粒細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)顯著低于VA≥0.70 μmol/L 患兒，提示VA水平下降還能通過(guò)抑制新生兒中性粒細(xì)胞的吞噬功能而降低新生兒非特異性免疫力，從而在一定程度上導(dǎo)致了新生兒CAP的發(fā)生。

綜上所述，CAP新生兒外周血VA水平、中性粒細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)下降，VA水平與新生兒CAP發(fā)病率相關(guān)，VA缺乏的新生兒有較高的CAP發(fā)病的可能。CAP新生兒中性粒細(xì)胞吞噬功能降低可能與VA水平低有關(guān)。