全身正弦波交變電磁場對于高糖高脂飲食2型糖尿病大鼠神經病理性疼痛的影響*

胡國花，蔡 婧，蘭 娜△

1.陜西省西安市西電集團醫院麻醉科，陜西西安 710077;2.空軍軍醫大學生物醫學工程系，陜西西安 710032

糖尿病是全世界發病率最高的慢性非傳染性疾病，目前全球約有4.5億糖尿病患者，而我國糖尿病患者高達1.2億[1]。我國是全球糖尿病第一大國，糖尿病已成為制約我國社會經濟發展的一個重要醫學問題[2-3]。糖尿病主要分為1型糖尿病、2型糖尿病(T2DM)、妊娠糖尿病和其他類型糖尿病4種，其中T2DM占糖尿病發病總人數的90%以上，是最主要的糖尿病類型。T2DM患者因長期存在的高血糖狀態，會誘發機體包括心臟、神經、眼、腎臟的慢性損傷[4]。神經病理性疼痛是T2DM最常見的慢性并發癥，有近50%的T2DM患者會發生神經病理性疼痛，臨床主要表現為自發痛、誘發痛、痛覺過敏、痛覺超敏和異常性疼痛[5-6]。目前，臨床對于T2DM神經病理性疼痛尚無有效的治療對策，而常用的鎮痛藥、抗焦慮藥、抗炎藥和神經營養類藥物，不僅療效難以令人滿意，并且還存在著高藥物不良反應和耐藥性的問題[6-7]。交變電磁場治療是目前臨床常見的物理治療方法，其積極療效已在骨骼肌、皮膚及心血管相關疾病中得到了充分證實[8-9]。也有學者們發現交變電磁場具有明顯抑制疼痛的作用[10-11]。但是，交變電磁場治療對于糖尿病神經病理性疼痛(尤其是T2DM神經病理性疼痛)的作用效果，目前鮮見被系統闡明。本研究通過鏈脲佐菌素(STZ)聯合高脂高糖飲食法構建T2DM動物模型，系統探討交變電磁場輻照療法對于T2DM神經病理性疼痛的作用效果。

1 材料與方法

1.1實驗動物 3月齡雄性SD大鼠30只，SPF級，購于空軍軍醫大學實驗動物中心。

1.2儀器與試劑 鏈脲佐菌素(STZ)購于美國Sigma公司；血糖分析儀購于美國Lifescan公司；von Frey絲購于美國Stoelting公司；熱痛敏刺激和測量系統購于意大利Commat公司；cDNA反轉錄試劑盒購于北京天根生物技術公司；Maxima SYBR Green qPCR試劑盒購于美國Thermo公司；總RNA提取試劑Trizol購于美國Invitrogen公司。

1.3方法

1.3.1實驗設計 實驗大鼠飼養于溫度為(23±1)℃、濕度為(55±5)%及每日光照12 h的動物實驗室。使用STZ聯合高脂高糖飼喂法構建T2DM動物模型，具體步驟：SD大鼠使用高脂高糖飼料(包含10%豬油、10%蔗糖、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、5%蛋黃粉)飼養4周，隨后行過夜禁食處理，次日清晨通過腹腔注射濃度STZ緩沖液(35 mg/kg)，繼續高脂高糖飲食飼養4周，使用血糖儀測量大鼠隨機血糖值，血糖>16.7 mmol/L并表現出多飲、多食、多尿的“三高”癥狀的大鼠被認定符合T2DM標準。整個實驗共分為3組，分別為空白對照組(對照組)、T2DM組及T2DM交變電磁場治療組(T2DM+EMF組)，每組10只。給予對照組大鼠常規(非高糖高脂)飲食；對T2DM+EMF組大鼠施加全身性的正弦交變電磁場暴露8周，每周1 h；對照組和T2DM組大鼠同樣放入電磁線圈中，但不施加電流，作假暴露處理。

1.3.2交變電磁場發生系統 交變電磁場發生系統主要包括電信號發生器和Helmholtz線圈兩部分。電信號發生器以MSP430單片機為核心，負責輸出正弦波交變弱電信號，對產生的波形、頻率、強度等參數進行控制，并負責捕獲鍵盤的輸入信號，按用戶設定的命令進行輸出，該弱電信號經過信號調制、整流、濾波和放大處理后，將信號輸出至Helmholtz線圈。Helmholtz線圈包含2個直徑相同(線圈間距40 cm)且等軸放置的線圈組，線圈匝數為100，線圈間距20 cm。實驗動物飼養于塑料籠中，動物身體與線圈中軸線在同一水平面。實驗所產生的交變電磁場峰值強度為5 mT，頻率為50 Hz。

1.3.3機械痛閾值測定 在交變電磁場治療的第0、2、4、6、8周，分別對各組大鼠進行足底機械痛閾值的測定。測量前，將大鼠放置于金屬網中，其上方設有透明樹脂玻璃罩，令大鼠充分適應環境30 min。待充分安靜后，使用Von Frey纖維絲刺激大鼠后足中央，刺激過程中或移開纖維絲瞬間，大鼠出現明顯的抬足、躲避、舔腳等反應，將此次測量定義為陽性，記錄動作發生的時間。每一標號的纖維對每側足底刺激5次，即雙側10次，如出現5次以上陽性反應，則記錄該纖維力度。如果發現實驗動物出現5次不抬腿的情況，則更換更高刻度的纖毛。

1.3.4熱痛閾值測定 在交變電磁場治療的第0、2、4、6、8周，分別對各組大鼠進行足底熱痛閾值的測定。測量前，將大鼠置于獨立的有機玻璃籠中，令其充分適應30 min。使用熱輻射測痛儀對大鼠足底中部行熱光束照射，大鼠因無法耐受熱痛出現抬足反應，此時光束會自動切斷并自動記錄反應時間。每只大鼠的每側足底共刺激5次(雙側共10次)，每次間隔10 min，記錄10次測量值并取其平均值。

1.3.5脊髓細胞因子基因表達測定 交變電磁場干預8周后，通過使用腹腔注射過量戊巴比妥鈉溶液處死各組大鼠。通過RNA提取試劑盒提取腰段脊髓L5背角總RNA，以2 μg RNA為上樣量，按照試劑盒說明書步驟在20 μL反應體系中對RNA進行反轉錄反應生成cDNA。使用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀對所選目標基因進行PCR擴增，引物序列如表1所示。實時熒光定量PCR的反應體系：cDNA模板1.6 μL，上、下引物(濃度為10 μmol/L)各0.8 μL，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10.0 μL，最后使用去離子水將反應體系補充至20.0 μL。具體反應條件：95 ℃變性處理3 min，95 ℃、60 ℃各30 s，循環40次后，進行55 ℃退火處理15 s。每種基因設置4個復孔，使用2-ΔΔCt對IL-1β、TNF-α、IL-6和NGF基因的相對表達量進行半定量分析。

表1 本實驗實時熒光定量PCR檢測中所使用的引物序列

2 結 果

2.1全身正弦波交變電磁場干預對于T2DM大鼠隨機血糖的影響 與對照組大鼠相比，T2DM組及T2DM+EMF組大鼠的隨機血糖值在實驗的第0、2、4、6、8周均明顯升高(P<0.001)。T2DM+EMF組的隨機血糖值在交變電磁場刺激的第0、2、4、6、8周與T2DM組大鼠相比，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 全身正弦波交變電磁場干預對T2DM大鼠隨機血糖的影響

2.2全身正弦波交變電磁場干預對T2DM大鼠足底機械痛閾值的影響 T2DM組大鼠的足底機械痛閾值在實驗的第0、2、4、6、8周均明顯低于對照組大鼠(P<0.001)。T2DM+EMF組大鼠在交變電磁場干預之前(第0周)的足底機械痛閾值與T2DM組大鼠相比，差異無統計學意義(P>0.05)。但是，T2DM+EMF組大鼠在實驗第2、4、6、8周的足底機械痛閾值均明顯高于T2DM組大鼠(P<0.01)。T2DM+EMF組大鼠在實驗第0、2、4、6周的足底機械痛閾值均明顯低于對照組大鼠(P<0.05)，但是T2DM+EMF組與對照組大鼠的足底機械痛閾值在第8周差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 全身正弦波交變電磁場干預對T2DM大鼠足底機械痛閾值的影響

2.3全身正弦波交變電磁場干預對T2DM大鼠足底熱痛閾值的影響 T2DM組及T2DM+EMF組大鼠在第0、2、4、6、8周的足底熱痛閾值均明顯低于對照組(P<0.001)。T2DM+EMF組大鼠在第0周的足底熱痛閾值與T2DM組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。但T2DM+EMF組大鼠在實驗第2、4、6、8周的足底熱痛閾值均明顯高于T2DM組(P<0.01)。見表4。

表4 全身正弦波交變電磁場干預對T2DM大鼠足底熱痛閾值的影響

2.4全身正弦交變電磁場對T2DM大鼠脊髓IL-1β、TNF-α、IL-6和NGF基因表達的影響 T2DM組大鼠脊髓IL-1β、TNF-α和IL-6的基因表達水平明顯高于對照組(P<0.05)，而NGF基因的表達水平明顯低于對照組大鼠(P<0.05)。T2DM+EMF組大鼠脊髓IL-1β、TNF-α和IL-6的基因表達水平明顯低于T2DM組大鼠(P<0.05)，而其脊髓NGF的基因表達水平明顯高于T2DM組大鼠(P<0.05)。但是，對照組與T2DM+EMF組大鼠之間的脊髓IL-1β、TNF-α、IL-6和NGF基因表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 全身正弦波交變電磁場干預對T2DM大鼠脊髓IL-1β、TNF-α、IL-6和NGF基因表達的影響

3 討 論

隨著20世紀70年代Bassett首次應用電磁場成功治療骨折與骨不連的延遲愈合，電磁場的非熱生物學效應日益得到國內外研究學者的廣泛關注。而被學者們所認可且廣泛使用的電磁場治療場包括脈沖電磁場、正弦波交變電磁場以及穩恒磁場。其中正弦波交變電磁場由于可以直接由市電直接轉換得到，因此憑借其簡單易得、所輸出的電磁設備成本相對較低的優勢，得到基礎醫學和臨床醫學研究人員的廣泛關注。研究表明，正弦波交變電磁場對于促進皮膚損傷愈合、加速骨創傷修復、改善微循環以及抑制腫瘤生長等具有積極治療效果[8-9,12-13]。近年來，一些研究也發現正弦波交變電磁場具有明顯的消炎和鎮痛效應[10-11]。但是，正弦波交變電磁場對于糖尿病引起的神經病理性疼痛的作用效果及機制，目前國內外鮮見系統的研究報道，而其對于發生率更高的T2DM所誘發的神經病理性疼痛則更具臨床應用價值。

本研究使用高糖高脂飲食飼喂8周并結合以低劑量STZ腹腔注射的方式構建T2DM大鼠動物模型，該實驗步驟與方法已被國內外學者們使用，并被證實能夠成功誘導T2DM動物模型[14-15]。該動物模型也被認為是迄今最為經典的誘發型T2DM動物模型，被廣泛用于T2DM及其并發癥的動物實驗研究[16]。本實驗結果也發現，該方法所誘導的大鼠具有高血糖、肥胖、多飲、多食、多尿等特征，與臨床T2DM患者的癥狀一致。更重要的是，本研究行為學檢測結果揭示，T2DM組大鼠相比于對照組大鼠表現出足底機械痛閾值和熱痛閾值明顯降低，而這與臨床T2DM神經病理性疼痛患者對于外部刺激疼痛承受能力降低的現象一致，提示糖尿病神經病理性疼痛模型構建成功。而經過全身正弦波交變電磁場暴露的大鼠，其足底機械痛閾值和熱痛閾值在刺激的第2周起就明顯高于無電磁輻照的T2DM大鼠，且這對疼痛閾值的改善隨著治療進程的推進則越為顯著，本研究結果提示交變電磁輻照療法對于T2DM神經病理性疼痛具有改善作用。

在T2DM神經病理性疼痛的發生、發展進程中，脊髓炎性反應發揮了至關重要的作用[17]。IL-1β、TNF-α和IL-6作為最常見的促炎因子，已被證實在T2DM神經病理性疼痛脊髓中具有明顯的高表達特性[18]。也有研究發現，通過抑制脊髓中這些炎癥因子的表達，能夠明顯改善糖尿病神經病理性疼痛癥狀[19]。本實驗發現，高糖高脂飲食誘導的T2DM大鼠脊髓中IL-1β、TNF-α和IL-6的基因表達水平明顯高于非糖尿病大鼠，這與先前的臨床結果保持一致。有趣的是，本研究發現全身交變電磁場治療8周后，T2DM大鼠脊髓中IL-1β、TNF-α和IL-6的基因表達水平均明顯降低。本研究結果提示，交變電磁場輻照療法具有明顯的抑制脊髓神經炎癥的作用效果。其次，NGF是一種具有重要神經保護作用的細胞因子，對于促進軸突的生長具有重要作用，而機體NGF表達的改變會誘發神經元的功能障礙和死亡[20]。有研究也發現外源性施加NGF對于改善神經病理性疼痛癥狀具有積極效果[21]。本研究發現T2DM組大鼠脊髓中NGF基因表達水平明顯低于對照組大鼠，這與先前的研究結果保持一致[22]；當經過電磁場治療8周后，T2DM脊髓中NGF基因表達水平明顯增加，提示交變電磁場對于促進脊髓中神經營養因子的表達具有正向調控作用。

綜上所述，全身性的正弦波交變電磁場輻照療法能夠明顯改善高糖高脂飲食所誘導的T2DM大鼠神經病理性疼痛癥狀，而這一效應與其抑制脊髓神經炎癥和促進神經生長因子表達有關。作為一種無創、經濟、安全的物理治療手段，全身性的正弦波交變電磁場有望成為臨床治療T2DM神經病理性疼痛這一棘手問題的有效途徑。