野鳶尾黃素對人卵巢癌SKOV3細胞增殖、遷移和侵襲的影響

畢彩云，夏 巖

陜西省西安市北方醫院婦科，陜西西安 710000

目前，卵巢癌的標準治療方法是手術后聯合化療，但因缺乏前期篩查試驗及存在很高的復發率，仍然是最致命的婦科癌癥[1-3]，因此，尋找新的治療策略，抑制其復發顯得尤為重要。據報道，中藥在腫瘤的治療中具有改善患者生存質量、降低轉移復發率等優勢。野鳶尾黃素是一種從中藥提取的活性黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化及抗腫瘤活性。基于此，本研究擬研究野鳶尾黃素對卵巢癌SKOV3細胞增殖、遷移、侵襲及上皮-間質轉化(EMT)的影響及可能的調節機制。

1 材料與方法

1.1材料來源 人卵巢癌SKOV3細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；FBS、RPMI-1640培養基、青鏈霉素均購自美國HyClone公司；胰島素購自美國Sigma公司；野鳶尾黃素購自美國MCE公司；GAPDH、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin抗體購自美國Proteintech公司；Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 人卵巢癌SKOV3細胞采用RPMI-1640完全培養基于37 ℃恒溫培養箱中培養，待細胞融合度達到85%～95%時進行傳代及實驗。

1.2.2CCK-8實驗測定SKOV3細胞活力 實驗設定為6組，取處于對數生長期，生長狀態良好的SKOV3細胞以5×103個/100 μL，接入96孔板，37 ℃培養過夜；貼壁后加入不同水平(0、10、25、50、100、200 μmol/L)的野鳶尾黃素處理48 h，每孔加入10 μL CCK-8孵育30 min，并于酶標儀450 nm處測定其吸光度，根據吸光度計算不同濃度處理組SKOV3細胞活力。

1.2.3細胞分組與給藥方法 根據上述CCK-8實驗結果，將實驗分為對照組、低劑量組、高劑量組。對照組不加任何藥物，選擇加野鳶尾黃素后使SKOV3細胞的增殖能力下降1/3、2/3左右的兩個濃度為低劑量組、高劑量組濃度，處理48 h。

1.2.4細胞侵襲 制備濃度為2×104/mL的各組人卵巢癌SKOV3細胞無血清細胞懸液。24孔板底部加800 μL RPMI-1640完全培養基，Transwell小室上室底部中央垂直加入100 μL 1 mg/mL的Matrigel，待Matrigel干成膠狀后在Transwell上室分別加入200 μL各組細胞懸液，5%CO2、37 ℃培養箱培養24 h。取出Transwell小室，PBS清洗一側未侵襲細胞，并用10%甲醇溶液固定30 min。切下膜并在膜上滴1滴5%結晶紫染液，靜置染色20 min，PBS清洗后于顯微鏡(×40)下觀察拍照。實驗重復3次。

1.2.5細胞劃痕實驗 Marker筆在6孔板背后劃線，將人卵巢癌細胞SKOV3單細胞懸液(約2×105個)均勻接種到6孔板中培養過夜。第2天用槍頭比著直尺，垂直于背后的橫線劃痕。PBS清洗后加入無血清培養基、拍照，并于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，24 h后再次拍照，計算遷移距離。

1.2.6采用免疫印跡實驗檢測E-cadherin、N-cadherin、β-catenin蛋白的表達 各組人卵巢癌SKOV3細胞經冰凍PBS洗滌，在蛋白裂解緩沖液中提取，用Bradford法測定蛋白濃度后，變性并電泳分離。電泳后，蛋白質轉移到PVDF膜并于4 ℃過夜孵育內參GAPDH及E-cadherin(1∶100)、N-cadherin(1∶100)、β-catenin(1∶100)一抗。洗滌后，用辣根過氧化物酶偶聯的二抗孵育1 h，并用ECL化學發光系統觀察信號，計算目的蛋白相對于GAPDH的表達量，目的蛋白的相對表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

2 結 果

2.1野鳶尾黃素對SKOV3細胞活性的影響 CCK-8實驗檢測野鳶尾黃素處理的SKOV3細胞活性，結果顯示野鳶尾黃素處理48 h后各劑量處理組(0、10、25、50、100、200 μmol/L)細胞活力分別是(100.0±4.0)%、(90.6±2.6)%、(71.2±3.7)%、(62.6±2.6)%、(31.8±6.3)%、(18.8±6.6)%，其他劑量處理組的SKOV3細胞活性與0 μmol/L組相比，差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖1。這提示野鳶尾黃素可抑制SKOV3細胞的增殖，基于野鳶尾黃素濃度為50、100 μmol/L處理時，細胞的增殖能力下降1/3、2/3左右，所以選擇50 μmol/L(低劑量組)、100 μmol/L(高劑量組)進行后續的實驗。

注：與0 μmol/L組相比，*P<0.01。

2.2野鳶尾黃素對SKOV3細胞侵襲的影響 細胞侵襲實驗顯示，對照組、低劑量組、高劑量組侵襲的SKOV3細胞數量分別是(104.00±3.33)個、(83.00±3.33)個、(51.00±2.66)個，與對照組相比，低劑量組、高劑量組SKOV3細胞的侵襲能力均下降 (P<0.01)。見圖2。

圖2 Transwell小室實驗檢測野鳶尾黃素對SKOV3細胞侵襲能力的影響(×40)

2.3野鳶尾黃素對SKOV3細胞遷移的影響 細胞遷移實驗顯示，對照組、低劑量組、高劑量組SKOV3細胞24 h遷移的距離分別是(336±7)μm、(170±17)μm、(76±5)μm，與對照組相比，低劑量組、高劑量組SKOV3細胞的遷移能力均下降，差異均有統計學意義(P<0.01)，見圖3。

圖3 細胞劃痕實驗檢測野鳶尾黃素對SKOV3細胞遷移能力的影響

2.4野鳶尾黃素對SKOV3細胞E-cadherin、N-cadherin表達的影響 對照組、低劑量組、高劑量組E-cadherin蛋白水平分別為0.24±0.05、0.52±0.06、0.64±0.06，N-cadherin蛋白水平分別為0.53±0.06、0.30±0.06、0.22±0.05。與對照組相比，低劑量組、高劑量組細胞的E-cadherin蛋白表達均上升，N-cadherin蛋白表達均下降，差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖4。

圖4 免疫印跡實驗檢測野鳶尾黃素對SKOV3細胞E-cadherin、N-cadherin表達的影響

2.5野鳶尾黃素對SKOV3細胞β-catenin蛋白的影響 采用免疫印跡實驗檢測SKOV3細胞β-catenin蛋白的表達，結果顯示對照組、低劑量組、高劑量組β-catenin蛋白的水平分別為0.47±0.06、0.35±0.06、0.31±0.05，與對照組相比，低劑量組、高劑量組SKOV3細胞的β-catenin蛋白表達均下降，差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖5。

圖5 免疫印跡實驗檢測野鳶尾黃素對SKOV3細胞β-catenin蛋白表達的影響

3 討 論

卵巢癌是對女性健康影響最大的惡性腫瘤之一，雖然傳統的治療策略在一定程度上提高了卵巢癌患者的總生存率，但是腫瘤的侵襲、轉移、復發等惡性表型特征使得其病死率居高不下[1-3]。

野鳶尾黃素是一類從植物中提取的多酚類化合物，其結構與內源性雌激素相似，已被證實具有多種生物活性并被應用于多種疾病的治療[4-10]。ZENG等[9]研究表明野鳶尾黃素通過下調蛋白激酶B(AKT)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路以及上調Caspase家族的表達和(或)活性來抑制人乳腺癌細胞的增殖、侵襲、遷移。YEH等[11]研究表明野鳶尾黃素通過G0/G1期細胞周期阻滯抑制膠質母細胞瘤細胞的增殖。GUO等[12]研究表明，野鳶尾黃素對骨肉瘤細胞(Saos2和U2OS)的增殖具有一定的抑制作用，且具有劑量依賴性和時間依賴性，同時顯著抑制OS細胞的遷移和侵襲，上調Cleaved Caspase 3的表達，下調MMP-1、MMP-2和MMP-9的表達，從而發揮對骨肉瘤細胞的調節作用。由此推測野鳶尾黃素可能對卵巢癌發揮抑制作用，本研究中采用CCK-8實驗檢測野鳶尾黃素對卵巢癌SKOV3細胞增殖的影響，結果顯示野鳶尾黃素抑制SKOV3細胞的增殖并表現出濃度依賴性，同時野鳶尾黃素的加入抑制了SKOV3細胞的侵襲、遷移。

EMT在腫瘤的發生、發展中發揮重要作用，EMT促進癌癥轉移和復發[13-15]。為了評估野鳶尾黃素對SKOV3細胞遷移和侵襲的抑制作用是否與EMT相關，采用免疫印跡實驗檢測EMT標志物(E-cadherin、N-cadherin)的表達，結果顯示野鳶尾黃素增加了E-cadherin的表達，降低了N-cadherin的水平。

Wnt/β-catenin信號通路已被證明有助于EMT的轉移，同時Wnt/β-catenin通路在卵巢癌的進程中發揮重要調節作用[16]。因此，為了進一步驗證野鳶尾黃素抑制EMT的過程與Wnt/β-catenin信號通路相關，本研究采用免疫印跡實驗檢測Wnt/β-catenin信號通路的核心分子β-catenin的表達，結果顯示野鳶尾黃素可抑制β-catenin的表達。

綜上所述，本研究觀察了野鳶尾黃素對卵巢癌SKOV3細胞增殖、侵襲和遷移能力，以及E-cadherin、N-cadherin、β-catenin蛋白表達的影響，結果顯示野鳶尾黃素可能通過抑制β-catenin蛋白的表達，從而抑制SKOV3細胞的增殖、侵襲、遷移及EMT。