環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法與重組酶聚合酶擴(kuò)增法用于孕婦B族鏈球菌定植篩查的價(jià)值

馬小波，梁朝霞，吳 勇，何玉萍，劉鴻飛，董 艷

1.江蘇省南京市高淳中醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南京 211300；2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬沭陽醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇沭陽 223600；3.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬沭陽醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇沭陽 223600

B族鏈球菌(GBS)定植是發(fā)生早發(fā)型新生兒敗血癥的主要原因[1]。GBS定植具有起病隱匿、癥狀不典型的特點(diǎn)[2]。多方共識(shí)指出：孕35～37周進(jìn)行直腸及陰道GBS定植篩查有助于減少產(chǎn)婦分娩風(fēng)險(xiǎn)及新生兒感染風(fēng)險(xiǎn)[3-5]。GBS定植的篩查臨床上多以培養(yǎng)法作為判斷GBS定植的金標(biāo)準(zhǔn)，但培養(yǎng)法多需要48 h以上，其耗時(shí)長、靈敏度差[6]。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或熒光PCR雖然能夠減少鑒定時(shí)間，已經(jīng)逐漸取代培養(yǎng)法成為新型篩查方式，但其對儀器及設(shè)備的成本需求相對較高，不適合中小型醫(yī)院應(yīng)用[7]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)的反應(yīng)時(shí)間僅需幾十分鐘，反應(yīng)結(jié)束可通過肉眼直接觀察，簡單、高效[8]。重組酶聚合酶擴(kuò)增法(RPA)能在15 min內(nèi)進(jìn)行DNA擴(kuò)增，但缺乏有效的直接觀察方式[9]。兩種方法均屬于恒溫環(huán)境下來進(jìn)行DNA擴(kuò)增的有效方式，簡單、方便。為進(jìn)一步明確LAMP及RPA用于孕婦GBS定植篩查的價(jià)值故進(jìn)行本研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年5月至2019年7月在徐州醫(yī)科大學(xué)附屬沭陽醫(yī)院(以下簡稱該院)采集的68例孕35～37周孕婦陰道及直腸拭子作為主要檢測標(biāo)本。納入的孕婦在4周內(nèi)未進(jìn)行抗菌藥物治療。取孕婦肛周分泌物及陰道下三分之一處分泌物等分為3份，標(biāo)記后進(jìn)行孕婦GBS定植篩查。

1.2儀器與試劑 PCR儀(含染料，上海星漢生物科技有限公司，型號：2×Taq MasterMix)、高速離心機(jī)(常州市億能試驗(yàn)儀器廠，型號：TG16G)、電泳儀(南京普陽科學(xué)儀器研究所，型號：LG4C0818)、凝膠成像儀(賽默飛世爾科技公司，型號：E-Gel Imager凝膠成像儀-緊湊型凝膠成像系統(tǒng))、恒溫水浴鍋(蘇州珀西瓦爾試驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號：TZL-5002)、核酸染料(上海撫生實(shí)業(yè)有限公司，型號：SYBR GreenⅡ)。LAMP試劑盒(蘇州天隆生物科技有限公司，國械注準(zhǔn)20193400369)、RPA反應(yīng)試劑盒(廣州市寶創(chuàng)生物技術(shù)有限公司，國械注準(zhǔn)20213400530)、TwistAmp?LF免疫金試紙條(廣州市微米生物科技有限公司,國械注準(zhǔn)20193400250)。

GBS標(biāo)準(zhǔn)菌株選擇購自上海素爾生物科技有限公司的無乳鏈球菌ATCC13813菌株作為陽性菌株；將該院培養(yǎng)的化膿性鏈球菌、肺炎鏈球菌、星座鏈球菌、金黃色葡萄球菌、F組鏈球菌各1株作為陰性菌株。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本的處理 將采集的孕婦陰道及直腸拭子置于1 mL無菌蒸餾水中，10 000 r/min高速振蕩60 s，10 000×g離心300 s，棄去上清液；再加入0.1 mL無菌蒸餾水中沉淀后，再次離心，棄上清液；再加入0.1 mL無菌蒸餾水重懸沉淀后依據(jù)沸水浴法提取DNA，一份行LAMP檢測，一份行RPA檢測，另一份行16s rRNA測序，應(yīng)用GenBank數(shù)據(jù)比對確定細(xì)菌DNA。

1.3.2DNA提取方法 應(yīng)用移菌環(huán)自血平板上刮取培養(yǎng)完成的菌株，置入0.1 mL的無菌蒸餾水中，在沸水中水浴10 min，10 000×g離心2 min(分離線粒體)，取上清液備用，作為模板DNA(ATCC13813菌株為陽性模板，其他菌株為陰性模板)。

1.3.3LAMP 將LAMP試劑盒中的反應(yīng)液、顯色液FDR和2 μL的模板DNA置入0.5 μL的PCR管中，混合均勻，再置入63 ℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)0.5～1.0 h后取出，置入判定結(jié)果。

1.3.4RPA 嚴(yán)格按照RPA試劑盒說明書進(jìn)行操作，RPA反應(yīng)體系(47.5 μL)：10 μmol/L的上下游引物各2.4 μL，DNA模板2 μL、重組緩沖液29.5 μL，超純水11.2 μL制成混合液。將混合液移入預(yù)裝好凍干粉的反應(yīng)管中，混合均勻后加入2.5 μL MgAc，使最終反應(yīng)體積達(dá)到25 μL，置入PCR擴(kuò)增儀，運(yùn)行20 min。運(yùn)行4 min時(shí)，取出PCR管，輕彈并混勻，再放回38 ℃的恒溫儀中繼續(xù)孵育。運(yùn)行結(jié)束后將擴(kuò)增產(chǎn)物取出12.5 μL置入新的EP管中，后續(xù)經(jīng)DNA純化及瓊脂糖凝膠電泳，并將余下的孵育產(chǎn)物進(jìn)行TwistAmp?LF免疫金試紙條檢測。

1.3.5判定方法 LAMP結(jié)果判定：以反應(yīng)液變?yōu)榫G色作為陽性結(jié)果，反應(yīng)液無變色為陰性結(jié)果。RPA結(jié)果判定：以出現(xiàn)反應(yīng)條帶為陽性結(jié)果，無反應(yīng)條帶為陰性結(jié)果。本研究以ATCC13813菌株檢驗(yàn)結(jié)果為陽性對照組，其他標(biāo)本為陰性對照組，并以16s rRNA測序結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.6評估方法

1.3.6.1靈敏度評估 取無菌雙蒸餾水對待測模板DNA做10倍梯度遞減稀釋，并以模板DNA檢驗(yàn)情況最低濃度判斷。同時(shí)對比不同檢測方法的陽性結(jié)果準(zhǔn)確率。

1.3.6.2特異性評估 以陰性菌株為模板，應(yīng)用LAMP、RPA檢測，并進(jìn)行評估，以確定LAMP、RPA對GBS的診斷特異性。

1.3.6.3時(shí)效性評估 采集自開始檢驗(yàn)至檢驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的時(shí)間差進(jìn)行比較，確定兩種檢驗(yàn)方法的時(shí)效性差異。

1.3.7觀察指標(biāo) 觀察LAMP及PRA的最佳引物、反應(yīng)條件、反應(yīng)時(shí)間及檢測的靈敏度、特異性。

2 結(jié) 果

2.1LAMP和RPA的最佳引物和反應(yīng)條件對比 本實(shí)驗(yàn)自5組LAMP引物中選擇一組反應(yīng)迅速、特異性高的引物作為最佳引物，該引物最佳反應(yīng)條件：63 ℃，反應(yīng)45～60 min。反應(yīng)45 min時(shí)，LAMP檢測管顏色自橙色逐漸轉(zhuǎn)為綠色標(biāo)本為陽性，延長時(shí)間至60 min無顏色變化，陰性標(biāo)本為橙色。RPA的引物以F3、B3為主，其最佳反應(yīng)溫度為38 ℃，恒溫15 min。見表1。

表1 最佳引物序列

2.2兩種方法的靈敏度及特異性對比 經(jīng)LAMP及RPA檢測，45 min時(shí)，ATCC13813菌株DNA模板水平在0.01～10.00 ng/μL時(shí)，兩種檢測方法均能夠有效篩查陽性標(biāo)本，檢驗(yàn)極限均為0.01 ng/μL。經(jīng)LAMP及RPA檢測確定，而對于陰性菌株可以明確排除。兩者的特異性一致。見表2。

表2 LAMP及RPA特異性比較

2.3兩種方法的時(shí)效性及準(zhǔn)確性對比 68例標(biāo)本中共6例陽性、62例陰性，GBS定植率為8.82%。LAMP共耗時(shí)69 min，LAMP測定僅需要恒溫儀即可判讀；RPA測定68例標(biāo)本，共耗時(shí)130 min，需要使用恒溫儀、電泳儀和凝膠成像儀或免疫金試紙條才能產(chǎn)生準(zhǔn)確結(jié)果。兩種檢測方法臨床準(zhǔn)確性比較，LAMP共檢出6例陽性、62例陰性，與16s rRNA測序結(jié)果完全一致；而RPA電泳法共檢出7例陽性(假陽性1例)，61例陰性；RPA免疫金試紙條檢測與LAMP測定結(jié)果一致，僅需20～30 min即可完成。

3 討 論

GBS定植篩查已經(jīng)成為發(fā)達(dá)國家對孕35～37周篩查的主要指標(biāo)之一。研究顯示，孕晚期婦女GBS定植率為15.58%，以30～40歲孕產(chǎn)婦多見[10]。這一結(jié)果與本研究納入標(biāo)本的GBS定植率8.82%(6/68)大致相當(dāng)[11]。我國民眾對GBS的了解少，故GBS定植篩查的普及率相對較低；而且受到篩查時(shí)間、篩查技術(shù)難度及費(fèi)用昂貴的限制，多數(shù)孕期婦女對GBS認(rèn)識(shí)不足，難以建立有效的GBS定植篩查機(jī)制[12]。隨著GBS DNA診斷技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)逐漸成熟，但是在中小型醫(yī)院由于經(jīng)費(fèi)等原因仍難以普及[13]。

LAMP及RPA能夠減少早期篩查成本，降低篩查時(shí)間損耗，靈敏度高、特異性好，與PCR技術(shù)相比，經(jīng)濟(jì)價(jià)值及診斷效能更佳。與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，LAMP及RPA更加快速、方便，且對設(shè)備需求度低[14]。LAMP采用6個(gè)不同區(qū)域靶基因制訂4條特殊引物，經(jīng)過起始及循環(huán)擴(kuò)增形成最終的花椰菜樣莖-環(huán)狀結(jié)構(gòu)DNA混合物[15]。在LAMP反應(yīng)過程中，焦磷酸鎂沉淀作為主要副產(chǎn)物存在，使得肉眼能夠有效分辨熒光染料，具有可視性，但LAMP的引物設(shè)計(jì)較為復(fù)雜，在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用程度[16]。

RPA與LAMP相比，反應(yīng)溫度更接近人體體溫，在37～42 ℃進(jìn)行，單鏈核酸重組酶UvsX與引物相結(jié)合，利用Bsu DNA聚合酶實(shí)現(xiàn)鏈置換，在這個(gè)置換過程中，引入單鏈DNA結(jié)合蛋白Gp32核酸蛋白形成復(fù)合體，在多種因子共同作用下，基因鏈的延伸與配對過程才能實(shí)現(xiàn)[17]。但由于反應(yīng)情況無法進(jìn)行視覺診斷，多應(yīng)用凝膠電泳成像技術(shù)進(jìn)行定性檢測，但低濃度模板可能出現(xiàn)非特定信號污染，其診斷時(shí)效性及準(zhǔn)確性較低[18]。但結(jié)合免疫金試紙條技術(shù)能夠減少低濃度模板的信號污染，避免假陽性標(biāo)本產(chǎn)生，且基因擴(kuò)增完成后即可進(jìn)行檢測，顯像僅需5 min，有效地彌補(bǔ)了RPA在GBS定植篩查過程中的缺陷[19]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LAMP的基因擴(kuò)增對設(shè)備需求更低，適合基層醫(yī)院應(yīng)用；而RPA擴(kuò)增后應(yīng)用免疫金試紙條進(jìn)行定性檢測，耗時(shí)更短，且結(jié)果與LAMP一致，雖然增加一定的檢驗(yàn)成本，但節(jié)約檢測時(shí)間，適合中型以上醫(yī)院選用[20]。LAMP和RPA(免疫金試紙條判讀)的靈敏度及特異性一致。

綜上所述，LAMP及RPA對設(shè)備依賴程度較低，RPA基因擴(kuò)增速度快，LAMP總耗時(shí)相對較短，且具有可視性，RPA擴(kuò)增后采用免疫金試紙條方式診斷靈敏度及特異性與LAMP一致，兩種方法均具有簡單、高效的特點(diǎn)，適用于孕婦GBS定植篩查。