重慶市真菌形態學室間質量評價的建立及運行分析

王淑玲，張 震，徐蘭蘭，顏 令，廖 璞

重慶市人民醫院檢驗科，重慶 400014

2016年12月9日，原國家衛生和計劃生育委員會發布《關于提高二級以上綜合醫院細菌真菌感染診療能力的通知》，要求地方各級衛生行政部門要加強對二級以上綜合醫院細菌真菌感染診療能力建設的指導和監督，不斷提高其細菌真菌感染診療水平。目前，真菌感染的發生率不斷增加，實驗室對真菌感染的檢測方法主要有直接鏡檢、微生物培養、血清學實驗和分子生物學檢測。真菌的檢測起步晚，真菌檢測大多仍是通過形態學鑒定。感染性疾病的醫療診治大多基于實驗室的檢測結果,這些結果可以影響臨床診斷治療。形態學往往是微生物檢驗人員的薄弱環節,應培養微生物人員學習真菌形態學知識的興趣,并保證檢驗質量。基于現狀，重慶市臨床檢驗中心率先開展了真菌形態學的室間質量評價(以下簡稱室間質評)，并在重慶市初步實施，本研究通過對2019—2021年3次室間質評結果的分析，了解重慶市實驗室真菌形態學讀片能力和存在問題，以更好地為臨床服務。

1 材料與方法

1.1真菌菌落圖片及鏡下形態圖片制作 收集臨床工作中分離的典型菌株，接種于血平板、沙保羅瓊脂培養基(SDA)及馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)，28 ℃或35 ℃培養,培養時間根據真菌生長速度而不同。用相機拍攝菌落形態和染色鏡下典型圖片，根據真菌特點選擇革蘭染色、乳酸酚棉蘭染色、熒光染色、墨汁染色、生理鹽水濕片、六胺銀染色或臨床標本KOH濕片，低倍鏡或高倍鏡下拍攝形態圖片，圖片刻錄光盤。

1.2室間質評方法 2019—2021年開展3次室間質評，重慶市臨床檢驗中心每次發放5個樣品，重慶市參加室間質評的實驗室按照通知信息收到讀片并在規定日期前檢測和上報。

1.3評價方法 依據《CNAS-GL002：2018能力驗證結果的統計處理和能力評價指南》[1]，統計參評實驗室對質評標本的測定結果與預期結果的符合程度。真菌讀片鑒定種屬均正確得20分(部分少見真菌例外)，屬正確部分符合得10分，其他不得分。總分≥80分為合格。

1.4統計學處理 采用SPSS20.0軟件進行數據處理。計數資料以例數、百分率表示，比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1參加真菌形態學室間質評并上報數據的實驗室數和合格率 2019—2021年，參加該項目室間質量評價的實驗室數從28家增加至53家，合格率從53.6%增加到94.3%，見表1。

表1 參加真菌形態學室間質評的實驗室數和合格率

2.2參加真菌形態學室間質評的實驗室構成和合格率 2019—2021年，參加室間質評的實驗室主要是綜合性二、三級醫院的實驗室。二級醫院實驗室合格率由50.0%上升到90.9%。在2019—2021年，三級醫院實驗室合格率均高于二級醫院實驗室，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2019-2021年參加真菌形態學室間質評的實驗室構成和合格率

續表2 2019-2021年參加真菌形態學室間質評的實驗室構成和合格率

2.3真菌形態學讀片結果 2019—2021年共發放15個標本，完全符合率在32.1%～100.0%。實驗室對常見真菌讀片完全符合率高于少見真菌，如常見煙曲霉復合群完全符合率為92.7%，黑曲霉復合群完全符合率為96.2%；少見的阿薩希毛孢子菌完全符合率為57.1%，鐮刀菌屬完全符合率為82.1%，木霉屬完全符合率為83.0%。見表3。

表3 真菌形態學讀片結果

3 討 論

在真菌病的診治過程中,病原真菌的鑒定是至關重要的一環,對真菌病的成功治療具有重要的指導價值。盡管分子生物學真菌鑒定方法具有快捷、精準的特點,但因成本費用所限,普及程度并不高,并且試劑盒之間存在很大差異[2]。基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)應用于臨床酵母菌菌種鑒定且成效顯著,但是由于絲狀真菌的蛋白質提取難度大，所以MALDI-TOF MS在絲狀真菌鑒定效能及應用程度受到影響[3]。而真菌形態學鑒定方法試劑簡單、費用低廉、開展方便，具有診斷的直觀性[4],故迄今為止,真菌形態學鑒定方法依然是臨床實踐中傳統可靠的診斷方法，但也是微生物檢驗人員的薄弱環節。

目前重慶市開展真菌檢測并參加真菌形態學室間質評的主要是三級和二級醫療機構實驗室，三級醫療機構實驗室符合率高于二級醫療機構實驗，而二級醫療機構實驗室符合率提高比較快。實驗室重視程度和人員學習積極性在增加。

真菌形態學鑒定通過觀察真菌在培養基上的生長速度、顏色和菌落質地，借助顯微鏡觀察菌絲結構和孢子發生來鑒定真菌[5]。重慶市臨床檢驗中心從2019年開始建立并逐步完善真菌形態學室間質評體系，2019—2021年3次室間質評圖片覆蓋了10個菌屬，涉及了酵母菌、酵母樣菌和絲狀真菌。每種菌提供典型菌落形態(提供培養信息)、顯微鏡下典型特征和經典染色圖片。真菌形態學室間質評考核了分枝分隔的透明菌絲；寬大、無隔、透明菌絲及暗色菌絲；瓶梗產孢的曲霉、木霉；孢子囊產孢的根霉；孔出產孢的鏈格孢屬；環痕產孢的尖端賽多孢菌；關節孢子的阿薩希毛孢子菌和大、小分生孢子的須癬毛癬菌。而對這些形態的認知能力是臨床微生物實驗室真菌檢測能力建設的基本要求[6]。實驗室人員對常見真菌的讀片能力好于少見真菌。隱球菌引起的肺炎和腦膜炎，臨床表現差異大及缺乏特異性，預后差，病死率高，需要檢驗科提供快速、準確的結果。臨床標本中經典染色方法為墨汁負染，原始標本革蘭染色也可看到寬大、不著色莢膜區。對新型隱球菌讀片的第1次(201921號)完全符合率為32.1%，重慶市臨床檢驗中心根據反饋結果采取相應的措施，第2次(202024號)發放隱球菌，完全符合率為100.0%。曲霉菌是實驗室分離最多的絲狀真菌，各實驗室對常見煙曲霉復合群(202022號)和黑曲霉復合群(202123號)的讀片完全符合率高，分別為92.7%和96.2%，土曲霉復合群(202023號)完全符合率為87.8%，少見的雜色曲霉復合群(201922號)完全符合率僅為35.7%。曲霉鏡下鑒別點主要是通過菌落形態和分生孢子頭結構加以區別[7]。我國是農業大國，植物性外傷是發生真菌性角膜炎的主要因素，鐮刀菌屬是真菌性角膜感染的最常見病原菌[8]。角膜刮取物涂片可查見菌絲，可根據培養菌落顏色、大小分生孢子形態、厚壁孢子有無進行種間鑒別，部分鏡下難以區分時需要進行測序鑒定。2次發放茄病鐮刀復合群，完全符合率由82.1%升到100.0%。201923號標本目標真菌為阿薩希毛孢子菌，有16家實驗室回報正確，另外有11家實驗室回報熱帶念珠菌。阿薩希毛孢子菌屬于毛孢子菌屬，是一種條件致病菌，為酵母樣真菌，可引起免疫缺陷患者各種機會性感染，鏡下結構非常豐富[9-10]。阿薩希毛孢子菌和熱帶念珠菌在CHROMagar 念珠菌顯色培養基上均顯藍色，但熱帶念珠菌革蘭染色鏡下只有芽生孢子和假菌絲，而阿薩希毛孢子菌可見真、假菌絲和芽生、關節孢子，可用于區分這兩種真菌。

臨床檢測工作中，建立質量控制已是常態，但真菌形態學還沒有制訂標準。重慶市臨床檢驗中心3次發放真菌形態學圖片，微生物人員開始重視對真菌形態的學習，各實驗室之間一致性和正確性逐漸提高。另外，微生物人員應加強對少見真菌的學習，這樣才能更好地服務臨床，這也是室間質評的目的所在。