1例Rh(D
--)表型的臨床及分子生物學研究

張 知，王長奇，葉水文，高宏軍，付國昌，王 康△

1.江西省贛州市立醫(yī)院檢驗科，江西贛州 341000;2.江西省臨川嘉德第三醫(yī)院檢驗科，江西撫州 344100；3.南昌大學第二附屬醫(yī)院中西結合科，江西南昌 330006；4.江蘇省諾貝爾獎得主蒂姆亨特研究院輸血醫(yī)學研究中心，江蘇無錫214400

近10年，Rh血型系統(tǒng)的研究取得了豐碩成果和較大進展，積累了大量分子生物學的研究資料，但是各種RHCE變異型形成的原因及其臨床意義，Rh抗體產生的機制及意義等未知的領域有待進一步研究[1]。

近來作者在老年人中發(fā)現(xiàn)1例D為陽性、CcEe不表達的DC-c-E-e-(或者D--)表型患者，案例較為罕見。通過基因檢測，證實為RHCE*Ce/RHCE*Ce基因型。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 患者，男，82歲，江西撫州人，由于反復咳嗽，加重1 d而入院。

1.2儀器與試劑 試劑：ABO/RhD血型定型檢測試劑卡(批號：202107003)、Rh血型分型檢測卡(批號：202106033)、抗人球蛋白(抗IgG)檢測卡(批號：202012022)均由江蘇力博醫(yī)藥生物技術股份有限公司提供；人類紅細胞RHCE血型基因分型試劑盒(熒光PCR法)(批號：20210401)、RHCE外顯子(科研)測序試劑盒(批號：20210401)均由江蘇中濟萬泰生物醫(yī)藥有限公司提供；血液基因組DNA提取試劑盒(杭州博日公司)等。儀器：LB-3000血型卡離心機、LB-C02-1試劑卡孵育器均由無錫源博生物科技有限公司提供；離心機(日本久保田公司)；熒光定量PCR儀(杭州博日公司)；ABI 3730型基因分析儀(美國AB公司)。

1.3方法

1.3.1血常規(guī)檢測 按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》在醫(yī)院進行檢測。

1.3.2血清學試驗

1.3.2.1ABO血型正反定型及RhD定型實驗 按照ABO/RhD血型定型檢測試劑卡的說明書操作步驟，進行ABO血型正定型、反定型及RhD血型定型。

1.3.2.2Rh血型定型實驗 按照 Rh血型分型檢測卡的說明書操作步驟，進行Rh血型系統(tǒng)的C、c、D、E、e抗原的檢測。

1.3.2.3不規(guī)則抗體測定 按照抗人球蛋白(抗IgG)檢測卡的說明書操作步驟進行抗體測定。

1.3.3分子生物學實驗

1.3.3.1血液基因組DNA的提取 按照血液基因組DNA提取試劑盒的說明書操作步驟提取基因組DNA。

1.3.3.2RHCE基因熒光分型 按照人類紅細胞RHCE血型基因分型試劑盒(熒光PCR法)的說明書操作步驟進行基因分型。

1.3.3.3RHCE基因外顯子測序 按照RHCE外顯子(科研)測序試劑盒的說明書操作步驟進行基因測序。測序結果與GenBank中RHCE基因的標準序列進行比對分析。

2 結 果

2.1血常規(guī)檢測 白細胞總數(shù)14.22×109/L，嗜中性粒細胞比例78.21%，淋巴細胞比例14.81%，單核細胞比例6.28%，嗜堿性粒細胞比例0.08%，嗜酸性粒細胞比例0.62%。

2.2血清學鑒定結果 ABO/RhD 血型抗原檢測中發(fā)現(xiàn)，患者ABO血型為O型，RhD 血型檢查為 D 陽性；Rh 血型分型鑒定D為陽性，CcEe均不表達；不規(guī)則抗體測定，結果均為陰性。

2.3RHCE基因序列分析 經序列測定和參考序列比對分析發(fā)現(xiàn)，WK712和WK713位于 RHCE基因第1外顯子編碼區(qū)的48位堿基由G突變?yōu)镃(c.48G>C)，為純合突變；第2外顯子編碼區(qū)150位堿基由C突變?yōu)門(c.150C>T)、178位堿基由C突變?yōu)锳(c.178C>A)、201位堿基由A突變?yōu)镚(c.201A>C)、203位堿基由A突變?yōu)镚(c.203A>G)、307位堿基由C突變?yōu)門(c.307C>T)，所有突變點均為純合突變。確定患者的RHCE基因型為 RHCE*Ce/RHCE*Ce 。測序結果見圖1。

圖1 患者外顯子1、2測序結果圖

3 討 論

本例患者外表正常，出生時并無雙胞胎，無輸血史和干細胞移植史，由于反復咳嗽，加重1 d支氣管肺炎而入院，無貧血病史。在醫(yī)院檢查中，Rh血型分型為 D 陽性，CcEe不表達；患者不規(guī)則抗體測定結果為陰性；RHCE 基因熒光分型為 CCee。 根據(jù) ZHAO 等[2]報道的體系擴增 RHCE 基因 10 個外顯子片段，測序分析，該標本 RHCE 基因型符合RHCE*Ce/RHCE*Ce。本例患者與其他報道[3-5]有差異，導致 RhCE 抗原不表達的原因有待進一步探討。

國內對 CcEe 表型的研究，RhD(+) 個體>90%是 CCee、CcEe 和 Ccee 表型，其中以 CCee 最多，占 51.82%[6]；本例患者表型是 CCee。Rh血型是一種較為復雜的血型系統(tǒng)，Rh抗原能引起嚴重的免疫反應和新生兒溶血病。2000年原衛(wèi)生部發(fā)布的《臨床輸血技術規(guī)范》明確要求檢測RhD抗原，但未規(guī)定檢測CcEe抗原。然而，當供者與受者CcEe抗原表型不合進行輸血時常會導致相應同種抗體的產生。本例患者沒有輸血；如果病情需要進行臨床輸血，且不檢測CcEe 抗原進行配合輸注，很可能發(fā)生輸血反應，不利于患者康復。因此作者認為如果能針對特殊個例進行Rh 5項全面檢測，條件成熟時建立和完善我國 D--稀有血型庫，對發(fā)生意外需要臨床輸血的患者會很有助益。尤其是對于有長期輸血需求的患者，CcEe抗原全部相合最為安全。

本例D--與RHCE基因異常有關，也存在基因變異體并形成CcEe 抗原變異體，這些變異體可導致血清學抗原鑒定或基因分型出現(xiàn)一些假陽性或假陰性[7-8]。本例CcEe 抗原的變異體無表達，常規(guī)檢測方法難以準確定型，可能導致同種免疫的發(fā)生，這樣患者日后輸血會面臨更大風險。應用RHCE 基因分型配合血清學分型技術，研究 RHCE 基因的多態(tài)性以及造成抗原表型多樣性，對于提高血清學檢測及分子定型的準確性，減少臨床輸血反應意義較大。

本例D--表型，經過RHCE基因檢測發(fā)現(xiàn)RHCE基因突變并不是該表型產生的分子機制。從檢測結果看，熒光分型和測序結果都判定為樣本基因型為RHCE*Ce/RHCE*Ce，血型理論上是CCee，但血清學試驗是C-c-E-e-。此種現(xiàn)象相當罕見，需要尋找其他分子機制解釋，下一步擬對標本進行家系調查。它的發(fā)現(xiàn)對我們進一步研究人類遺傳性疾病發(fā)生的分子基礎提供了寶貴的素材。相信經過廣大醫(yī)學工作者的努力，這一領域的研究一定會取得突破性進展。